转化生长因子β信号与软骨的发生、发育和维持*

张立智李双 吴文美 张世民

（同济大学附属杨浦医院骨科，上海 200090）

转化生长因子 β（transforming growth factor β,TGF-β）超家族包括TGF-β和骨形态发生蛋白（bone⁃morphogenetic protein,BMP）两个亚家族，30多个成员。它们参与了软骨细胞从早期到终末期的分化过程，包括细胞的聚合、增殖、终末分化和关节软骨的维持等。哺乳动物体内的TGF-β分子主要有3种:TGF-β1、β2、β3，在组织中分布不同。肋骨和脊椎软骨中高表达TGF-β3，很少表达TGF-β1和TGF-β2；软骨膜中TGF-β3表达也高于其他TGF-β。TGF-β2在四肢生长板的所有区域都有表达，在肥大区表达最高，而TGF-β1和TGF-β3主要表达在增殖和肥大区。在软骨发生早期TGF-β表达增加，而在软骨发育后期这些配体的表达均降低。研究还显示，颌部髁软骨发生过程中表达了所有的Smad蛋白，但在时间和空间上Smad信号子群体的表达不同[1]。因此，TGF-β贯穿了软骨的整个发生和发展过程，在该过程中可能起了关键的调节作用[2]。为深入了解TGF-β的调节作用和机制，本研究对TGF-β信号调节软骨的发生、发育和维持的相关研究做一综述。

1 软骨内成骨包括软骨发生和生长板发育

骨骼主要是由软骨和骨组成，除了头盖骨、中轴骨和四肢骨，骨骼大多是通过软骨内骨化，透明软骨板形成[3]。其过程首先是间充质干细胞黏附、聚集形成软骨原基，高表达各种细胞黏附分子如神经钙黏素（neural cadherin）和神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule）。这些分子不仅调节细胞和细胞间的相互作用，还促进软骨早期形成的转录因子Sox9的表达。Sox9能协同结构相关的转录因子Sox5和Sox6调节转录程序，促进Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型胶原，软骨蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的表达[3]。间充质干细胞黏附、聚集后，在聚集中心的细胞分化成软骨细胞，这些细胞从类成纤维细胞形态变成球形，细胞外基质分子合成增加；而聚集中心外周的细胞仍是成纤维细胞形态，继续表达Ⅰ型胶原，产生软骨膜结构。聚集过程在软骨细胞分化的过程中起重要作用，破坏聚集过程，将抑制间充质干细胞分化成软骨细胞[4]。

最初，在聚集中心的软骨细胞快速增殖，使骨骼发育呈线性增长；继之，在中心的软骨细胞退出细胞周期，进入成熟程序。由于细胞周期和阶段的不同，细胞在有序增殖和分化的过程中发生了分层，根据分化过程中软骨的细胞形态，可将生长板分为静息区、增殖区、肥大前区、肥大区。从静息期到肥大期，软骨细胞可经历一系列的分化、增殖、成熟和凋亡的过程，分泌不同的细胞外基质，并逐步被骨组织所替代。静止和增殖的软骨细胞都持续表达Sox9。相对静止的细胞（静息区）体积小，呈圆形，细胞排列紧密；快速增殖的细胞扁平呈柱状排列，形态上更平整，形成堆叠（增殖区）；有丝分裂后的细胞逐渐变大，以Sox9表达降低和表达印度刺猬因子（Indian hedgehog，IHH）为特征（肥大前区）；末期形成增大的软骨细胞（肥大区）。肥大区软骨细胞停止增殖进入终末分化阶段，细胞体积变大分泌Ⅹ型胶原，细胞外基质矿化；同时，分泌产生的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）13，能改造细胞外基质，有利于血管的侵入。终末分化的软骨细胞大多发生生理性死亡，留下细胞外基质，同时伴有成骨细胞、破骨细胞和血管侵入，最后成骨细胞分泌的骨基质取代软骨基质而实现骨化。

2 关节软骨的形成和维持

大多数生长板软骨最终被骨所替代，而胚胎阶段关节部位形成的关节软骨是永生性结构，不会被骨所取代[5]。成熟的关节软骨可分成不同区域，从关节软骨表面到骨可分为表面层、中间层、深层和钙化层。在细胞外基质成分、细胞组成和应力特性上，关节软骨与生长板软骨不同[6]。关节软骨细胞较少，就像定居的隐士细胞，具有特征性的细胞外基质，关节软骨比生长板软骨包含更多的胶原交联。然而，在骨关节炎病变中，关节软骨表型丢失，非肥大Sox9/5/6转录程序破坏，肥大软骨细胞发生末端分化，表达了Ⅹ型胶原和MMP13。软骨细胞分化受阻，进而导致永生化的软骨定居在长骨末端的机制仍不十分清楚。研究显示，TGF-β和软骨细胞内多种信号通路紧密相关，调控不同的软骨细胞增殖和分化，与软骨的生存形态和功能相关[7]。

3 TGF-β信号与前软骨细胞的聚合

间充质干细胞聚合时表达所有三个TGF-β亚型。体外研究显示，TGF-β1通过上调神经钙黏素和纤维连接蛋白表达，诱导间充质干细胞聚合，有利于间充质干细胞参与软骨发生。TGF-β2和TGF-β3可使黏多糖聚集提高两倍。动物实验研究有时会受到一定限制，敲除胚胎体内Tgfβ1基因，胚胎在骨骼开始发育前就会死亡；TGF-β1缺陷小鼠出生时还没有显示任何骨骼缺陷就死于弥散性炎症。激活素受体样激酶 5（activin receptor-like kinases 5,ALK5）是TGF-β信号转导的主要受体，敲除Alk5基因的小鼠在妊娠中期就发生死亡，在卵黄囊和胚胎期发育中血管出现严重的缺陷，妨碍了对骨骼形成的分析。如果在聚合发生前靶向骨骼的前驱细胞，条件性地敲除Alk5可导致软骨畸形和短肢；软骨细胞增殖分化，但异位的软骨组织伸入到软骨膜，表现为异常变薄的软骨膜层。微球培养实验显示，软骨内骨化时，Dullard基因对TGF-β信号有负调节作用，Dullard缺失提高了早期软骨聚集和分化，但是抑制了肥大软骨细胞矿化，TGF-β的Ⅰ型受体阻滞剂（LY-364947）能逆转这些反应[8]。

BMP的Ⅰ型受体（ALK3和ALK6）和BMP的配体拮抗分子（如TSG和Noggin）均表达于聚集的间充质以及早期的软骨原基。在模拟体内间充质聚集的高密度培养实验中，向间充质细胞中加入BMP可以诱导神经钙黏素的表达，从而加强细胞之间的相互作用，促进细胞聚集成团并分化为软骨细胞。在对鸡胚咽弓的研究中，BMP信号能通过改变特定的细胞形态进而促进背侧间充质干细胞的聚集[8]。Wang等[8]应用生化和基因的方法证实细胞分裂周期蛋白42（Cdc42）参与软骨发生，BMP2/Cdc42/p21-激活激酶（P21-activated kinase,Pak）/p38/Smad信号级联促进了间充质干细胞聚合；而TGF-β/Cdc42/Pak/蛋白激酶B(Akt)/Sox9信号级联促进了软骨细胞分化。可见，TGF-β基因在体内促进了间充质干细胞聚合，但其作用机制仍需进一步研究[9]。

4 TGF-β信号和关节的形成

TGF-β信号Ⅱ型受体（TGFβRⅡ）在躯干和四肢的关节形成过程中有着重要作用。TGFβRⅡ信号异常的鼠缺少趾间关节。完全敲除TGFβRⅡ可引起了卵黄囊血细胞生成和血管发生缺陷，直接导致妊娠10.5 d时胚胎死亡。TGFβRⅡ/单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein,MCP）-5轴也在关节的形成和软骨的发生中起着重要作用。最近研究证实关节中间区细胞因子MCP5表达降低，TGF-β信号可下调关节区细胞MCP5的表达，在四肢缺少TGFβRⅡ的鼠，中间区MCP5表达上调，关节不能发育[10]。

ALK5也是TGF-β信号的受体，它和TGFβRⅡ可联合在间充质干细胞中发挥作用，参与关节形成；两个受体发生突变时都可引起关节融合，但病变的特征各有特点。在间充质前驱细胞中条件性敲除了Alk5和TGFβRⅡ鼠发育异常，可表现为短肢侏儒症，胸骨异常，或关节形成异常。进一步的研究显示，条件性敲除TGFβRⅡ的鼠趾骨关节融合；而敲除Alk5的鼠具有正常的趾骨间关节，膝关节发生部分融合。另外，和敲除Alk5的鼠不同，在敲除TGFβRⅡ的鼠生长板中，软骨细胞增殖降低，晚期肥大分化延迟。这些提示，ALK5和TGFβRⅡ两种受体转导信号通路仍有一定区别，两者可能并不是同时转导TGF-β信号的。

5 TGF-β信号在生长板

软骨形成后，软骨细胞定向排列，有序增殖和分化形成生长板。生长板软骨中的软骨细胞类型增多，软骨细胞的成熟分化对于骨组织的生长起支配作用。TGF-β超家族对于生长板的发育成熟同样发挥很重要的作用。缺少TGF-β1的鼠出生后20天，没有出现生长板表型，就由于广泛的炎症反应和器官衰竭而死亡。类似，因为TGF-β3的缺失，在还没观察到软骨形成缺陷时，就导致了鼠围产期死亡。而TGF-β2缺陷的鼠在妊娠晚期可表现为广泛的软骨发育异常。在体外跖骨培养中，TGF-β2缺失阻止了外源性的音猬因子（sonic hedgehog，SHH）对软骨细胞肥大分化的抑制作用。在软骨细胞中条件性敲除TGFβRⅡ，可引起中轴骨骼缺陷、生长板肥大的分化改变和趾骨关节的融合。因此，TGF-β2在体内影响软骨发生中的作用可能更直接、更重要。

在四肢缺少TGFβRⅡ受体基因的鼠的生长板，IHH表达增高，Ⅹ型胶原α1表达水平的降低。TGFβRⅡ基因缺陷鼠出生后生长板内细胞增殖降低、成骨细胞成熟减少，头盖骨和长骨发育缺陷，身材矮小[11]。在肢体内已发生聚合的间充质干细胞和软骨细胞中，阻滞TGF-βRⅡ基因导致软骨发育不全，软骨细胞的肥大分化受损[12]。但进一步研究显示，在表达Col2α1的软骨细胞中，条件性敲除TGF-βRⅡ并没有影响胚胎期软骨内骨形成、导致四肢发育的明显缺陷[13]。值得注意的是，中轴骨Col2α1在体节激活，比在四肢内的软骨细胞Col2α1表达更早；在表达Col2a1的软骨细胞中，条件性敲除TGFβRⅡ表达，鼠的缺陷局限于中轴骨，表现为椎间盘和脊椎骨分节不良。这些研究提示，TGFβRⅡ转导TGF-β信号在软骨形成前期，而在后期可能并没有实质性的作用。

在TGF-β信号中，TGFβRⅡ对信号转导作用不同于其他受体。Iwata等[14]研究显示，TGF-βRⅡ缺失的突变鼠仍可表达TGF-β的信号。在颅骨神经嵴细胞内TGFβRⅡ的缺失可导致TGF-β2和Ⅲ型TGF-β受体（TGFβRⅢ，也称为β聚糖）高表达；TGFβRⅢ能在细胞表面保留TGF-β，然后提呈配体给TGFβRⅠ/TGFβRⅡ复合体，促进信号传递。TGFβRⅠ/TGFβRⅡ通过Smad2和Smad3转导TGF-β信号；然而，TGFβRⅠ/TGFβRⅢ是通过TAK1/p38途径转导信号。有趣的是，TGFβRⅢ对TGF-β2有高亲和力，而非 TGF-β1或者 TGF-β3。因此，利用 TGFβRⅠ/TGFβRⅢ信号路径可以解释，为什么在TGF-β2缺陷鼠中可以观察到骨骼发育缺陷的表型。有研究报道，ALK5能和其他的Ⅱ型受体如绵羊激活素受体Ⅱ（ACTRⅡ）形成复合体。TGF-β在软骨发生过程中是否可通过ALK5/TGFβRⅢ或ALK5/ACTRⅡ的复合体转导信号仍有待进一步研究。

Smad2和Smad3通过连接不同的Smad2/3结合子（Smad2/3 binding elements,SBEs），调节不同的抑制性复合物的组装，在生长板抑制了IHH表达，对成长板的发育起调控作用[15]。研究显示，Smad4可控制软骨细胞的增殖、分化，在调节生长板的细胞外基质成分中起着重要作用[16]。Smad7对中轴骨和四肢骨的发育都是必须的，能调节生长板内细胞的应激反应[17]。敲除Smad7表达的鼠内侧生长板中心细胞减少，软骨细胞内细胞周期损害和终末成熟缺陷。软骨细胞中完全丢失Smad1和Smad5的鼠中，存在严重的软骨发育异常。除了Smad信号在软骨发生中的重要作用，BMP信号也积极调节了间充质干细胞的聚合、软骨细胞增殖；负调节软骨细胞的终末分化[18]。

6 TGF-β信号与关节软骨的维持

随着软骨内成骨过程的结束，大多数生长板软骨最终被骨所替代，而关节软骨细胞必须终生保持未分化的状态并维持良好的胞外基质分泌功能才能保证关节的功能。关节软骨还必须能抵御各种各样的损伤因素，修复受损的关节软骨，否则关节软骨将随消耗和侵蚀而消失，引起关节病变。TGF-β超家族及其成员在关节软骨的维持中发挥重要作用。

软骨细胞形成软骨组织离不开自分泌和旁分泌的TGF-β信号。降低TGF-β2和TGF-β受体表达后，软骨细胞丧失形成类软骨组织的能力[19]。在牛滑膜体外培养中，TGF-β1能增强BMP2诱导的软骨发生，提高了新生软骨类透明软骨的特性，在早期肥大阶段阻止了细胞的下游分化[20]。在出生后软骨的内稳态维持中，TGF-β是软骨细胞末端肥大分化的抑制剂。软骨细胞的体外试验中，BMP9能作用于pSmad1/5，使软骨细胞呈类肥大状态；TGF-β1能促进间充质干细胞向软骨细胞分化，并通过Hippo信号通路抑制软骨细胞末端分化成肥大细胞[21]。TGF-β3也能抑制了从间充质干细胞中培养出的软骨细胞的末端分化。应用鼠肢芽细胞进行微团培养，TGF-β治疗延迟了软骨细胞成熟和肥大，抑制了Ⅹ型胶原、VEGF、MMP13和骨钙素的表达。TGFβRⅡ对于早期阶段的肥大是必需的，但在关节软骨细胞中，TGFβRII抑制了软骨细胞的终末分化和肥大。鼠出生后早期，敲除软骨细胞中TGFβRⅡ后，关节软骨组织内Runx2（Runt-related transcription factor 2），MMP13和金属肽酶含血小板反应蛋白-5表达上调，进展性出现类骨关节炎的表现[22]。以上研究提示，TGF-β能促进初级阶段软骨细胞的分化，抑制软骨细胞的末期肥大分化，这可能对维持关节软骨的完整性具有深远的作用。

TGF-β在不同受体的软骨中可发挥不同作用。ALK5可表达在鼠和人的软骨中，但在老龄化和骨关节炎的软骨中表达水平降低。敲除关节软骨内ALK5导致软骨降解酶MMP13表达水平增高，软骨细胞终末分化并降解，出现骨关节炎的表现[23]。与之相反，在人膝骨关节炎的软骨中，ALK1则和MMP13 mRNA表达之间有明显的相关性。另外，TGF-β在关节软骨中能通过ALK1激活经典的BMP信号途径,引起Smad1/5/8活化。此外,由于老龄化相关的ALK5表达降低，在老龄化和骨关节炎的关节软骨中ALK1/ALK5比率提高，进一步促进了信号通路从Smad2/3到Smad1/5/8转换相关[24]。由于在软骨中ALK1/Smad1/5/8和ALK5/Smad2/3信号通路具有相反的作用，TGF-β在通过不同的受体转导信号时发挥的作用也不同[25]。除此之外，TGFβ信号还可通过Smad2/3和Smad1/5影响关节内和关节周围多种组织，包括韧带、半月板、软骨下骨和滑膜，并且作用于Smad2/3或Smad1/5/8时，其保护或破坏作用也不同[26]。

研究显示，BMP信号对于关节软骨的维持同样不可或缺，关节软骨的损伤修复需要充足的BMP信号。适度的锻炼能提高表面区软骨细胞BMP2、BMP4、BMP6、BMPR2、pSmad5和DNA结合蛋白-1抑制剂的表达，抑制了软骨退变[27]。关节软骨细胞通过分泌抑制性调节剂如甲状旁腺激素相关蛋白（para⁃thyroid hormone-related protein，PTHrP）和BMP家族成员来抑制软骨细胞的肥大分化。单纯抑制经典的BMP信号并不能逆转软骨细胞肥大表型来产生软骨基质，通过添加PTHrP可改善肥大表型的分化[28]。BMP2和TGF-β1联合应用也能提高软骨的修复能力[29]。BMP和其他信号之间的协同和拮抗作用还可能和软骨细胞分化处于的阶段及作用模式有关。更多的BMPs和TGF-β在软骨损伤修复和抑制终末分化中的作用机制仍有待进一步研究。

综上，TGF-β超家族分子参与了软骨内成骨的整个过程，在软骨的发生、生长板的发育、关节的形成、以及关节软骨维持的各个阶段都发挥了重要作用。TGF-β超家族存在多种信号成分，转导信号的受体和途径又有不同。具有代表性的是经典TGF-β（Smad2/3）和BMP（Smad1/5/8）信号，其在软骨中的作用不同甚至相反。TGF-β分子可以促进软骨细胞细胞外基质合成，抑制软骨细胞的肥大分化和矿化。BMP分子可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞，促进软骨细胞分化和增殖，促进合成细胞外基质，抑制软骨细胞的终末分化，下调TGF-β信号，阻止TGF-β作用的效果。

尽管对于TGF-β信号成分及其生理学功能的研究取得了相当大的进展，但在软骨发育和维持的不同阶段，每种信号成分调控方式以及和其他信号通路之间的关联都有待进一步研究。如在软骨发育和维持中TGF-β可转导两种信号，它是如何利用BMP路径的，并和TGF-β信号相互作用的；ALK5，ALK1，Smad2和Smad4精确发挥拮抗和调节作用的机制等许多方面都有待进一步研究[30]。详细阐明TGF-β超家族分子发挥作用的具体机制，将会加深对骨软骨发育分子机制的理解和认识，有利于临床上对骨关节炎等疾病的预防、诊断和治疗[31]。