近海鱼类多样性调查新方法—环境DNA分析技术

高天翔，陈 治，王晓艳

（1.浙江海洋大学水产学院，国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003）

传统鱼类多样性调查方法具有诸多缺点[1-2]。近年来，以PCR、定量PCR及DNA条形码技术为基础，结合第二代高通量测序技术的环境DNA分析被广泛地应用于生态学研究中[3-6]。该方法直接从环境样品中提取DNA，采用定量检测、生物信息学分析等手段，实现对样品中所存在物种的有效检测，在近海鱼类多样性调查方面具有重要的实际意义和良好的应用前景。

1 环境DNA分析技术的概念及产生背景

生物多样性是维持生态平衡、促进人与自然和谐发展的重要成分，是生态系统稳定的关键因素，也是生态系统对环境变化响应与适应的重要指标。准确掌握水生生物在水体环境中的生物量及其时空分布是开展水生生物物种多样性保护的基本前提和重要基础[3]。以往的鱼类多样性调查主要采用围网、拖网、电鱼等传统研究方法[1-2,7-9]。这些调查方法普遍具有以下缺点：（1）调查费用高、所需时间久。水生生物调查，不仅需要准备网具、租赁船只，还需配备完整的调查人员和船舶驾驶人员。燃油动力费及人员劳务费亦是传统资源调查难以缩减的开支。一般性的鱼类多样性调查，少则几天，多则数年。费用高、时间久是传统调查方法的一个显著缺点[8]。（2）目标生物捕获率低[8-9]。水生生物，尤其是以鱼类为代表的水生游泳动物，往往具有较强的游动性，在水域出现的位置是不固定的。网具抓捕及鱼群探测器调查的结果具有很大的不确定性。调查面积及探测范围相对有限，水中鱼类等亦能根据“视听”等信息对网具和调查船只进行规避性游动。水域生态系统构成复杂，有些物种因体型小、数量少、隐蔽性强等原因难以被抓获，这使得鱼类多样性调查极为困难。因此调查结果往往不尽人意，基于传统调查方法的海洋鱼类捕获率普遍偏低[8-9]。（3）物种鉴别困难[8]。传统形态分类，需要专门的物种鉴别知识[10-11]。有些生物在特定的生长发育阶段极难鉴定种属，比如海洋鱼类的幼鱼及仔稚鱼时期，一般人员很难对捕获的渔获物进行准确定种。（4）环境破坏性大[1-2]。拖网、围网、电捕鱼、实地考察等传统方法搜集物种信息的方法，不仅对研究对象存在潜在伤害，而且对生物的栖息地环境存在程度不等的影响[8-9]。特别是拖网作业，对鱼类赖以生存的水域生态环境破坏巨大，极易导致海底生境荒漠化[12]。

简单、准确的物种多样性调查新方法，是更好进行水生生物监测工作的一个难点。环境DNA（environmental DNA，eDNA）分析技术，能够有效克服传统鱼类多样性调查方法的诸多缺点。环境DNA是生物体释放于环境中的DNA总称，主要来源于生物体的配子、皮肤碎屑、粘液或排泄物等[7]。从环境样品（水体、土壤、空气等）中直接提取DNA，不对任何目标生物进行分离，即监测生物存在信息的这种方法，在20世纪80年代末首先应用于微生物群落研究。随后20年间，环境DNA分析法在土壤、冻土、淡水和海水等环境中的微生物群落多样性和功能基因组研究中逐渐成型。

2 环境DNA分析技术的主要实现方法

环境DNA分析，主要通过PCR、定量PCR和高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术实现[3-11]。PCR，特别是定量PCR可对单一目标物种的存在、生物量及时空分布进行检测。无论是化石中的古生物、泥样中的生物残骸，还是水样中所遗留的生物毛发、皮肤、粘液或血液，只要能分离出少许的环境DNA样本，就能通过PCR加以放大，进行分析。这正是环境DNA结合定量PCR技术的威力所在。普通PCR只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量；而且只能在反应结束后借助电泳方法分析，无法对扩增反应实时检测；电泳检测的EB染液往往有毒[13]。而定量PCR技术，则摆脱了普通PCR技术的上述限制。其中，实时荧光定量PCR（qPCR）技术是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对环境样本起始模板的定量分析[13]。qPCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前被各实验室广泛使用。但qPCR技术所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应体系中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。数字PCR（dPCR）则是通过检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来直接计算目的核酸序列的拷贝数[13-14]。较qPCR技术有着高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的四大优势[14]。无论是普通PCR或者定量PCR，都需要种间特异性高、种内通用性强的扩增引物，否则极易出现假阳性或者假阴性的错误结果。两种定量PCR技术都只能对单一目标物种进行特异性检测。

传统DNA条形码技术是用基因组内一段标准化的DNA片段来鉴定生物物种的分子鉴定技术，已被广泛用于物种快速鉴定及起源、进化等研究领域[11]。但环境样本中的DNA往往为许多物种的总DNA。基于一代测序技术的DNA条形码分析和基于定量PCR分析的检测手段无法对环境DNA进行物种多样性监测研究。随着第二代测序技术的迅速发展，DNA高通量条形码（DNA metabarcoding）技术应运而生，给环境DNA研究带来了前所未有的革新[10,15]。DNA metabarcoding技术通过提取环境样品中的DNA并使用条形码基因通用引物进行扩增，利用PCR和第二代测序等分子技术，可以在短时间内获得可操作分类单元（operational taxonomic units,OTUs），通过与具有可靠物种分类信息的DNA条形码参照序列进行比对，从而实现对大量样本的物种鉴定及目标物种的信息获取[16-17]。与PCR、定量PCR及传统的DNA条形码技术仅能从单一样品中获取DNA信息相比，DNA metabarcoding技术能够直接从环境样品或生物混合样品中大批量识别物种，可对多物种进行同步检测，更加省时、高效、低成本，能够满足当前生物多样性快速评估的需求[18-19]。

3 环境DNA分析技术的优势

及时、准确掌握生物在环境中的分布、丰富度、群落形态是有效保护生物的基础[20]。海洋占地球表面积的71%，种类繁多的海洋生物是生物多样性研究的宝库。但由于海洋生物种类繁多、生活空间广阔，尤其是鱼类幼体浮游生活期长、分布范围内不存在明显地理屏障等，多数海洋鱼类群体通常在较大的分布范围内遗传分化很低，且其遗传结构在时间上具有不稳定性[21-22]。因此，研究海洋生物物种多样性和群体间相互关系等问题对于围网、拖网、电鱼等传统生态学研究方法存在较大挑战。同时，随着环境变化和全球范围内过度捕捞的加剧，许多海洋鱼类多样性已严重衰退，种群崩溃现象日益严重。高营养级的大型鱼类在渔获物中所占比例下降，而小型鱼类以及无脊椎动物等低营养级生物比重逐渐上升[23]。采用传统生态学调查方法，势必会对物种本身及其栖息地环境造成一定程度的损害，客观上加剧鱼类多样性的衰退速度。在海洋生态系统受损、食物网结构日趋简化、传统调查方法捉襟见肘的大背景之下，利用环境DNA技术，特别是环境DNA metabarcoding方法评估海洋生物多样性，量化分析关键种的资源丰富度，揭示其生态功能和作用，对指导海洋生物资源的保护及合理开发利用、探讨生物适应环境的遗传学机制具有重要意义。

与传统调查方法相比，环境DNA分析技术具有以下显著特点：（1）省时、省力、费用低。对亚洲鲤鱼Cyprinus carpio的研究，研究者采用电捕鱼监测法用时93 d，而eDNA技术只用了0.174 d[24]。对环境DNA分析所需要的现场调查，只需几升水而已，所以不需要特别专业的技术，普通人都可以简单地参与调查。既省去了船只租赁、人员劳务上的费用，又节省了调查作业及后续物种鉴定所需的时间。（2）调查灵敏度高。YAMAMOTO，et al[25]利用环境DNA技术对日本舞鹤湾鱼类多样性进行了调查，eDNA分析技术共检测出128种海洋鱼类。这128种海洋鱼类中，有23种是过去14年采用传统调查方法从未捕获过的。表明环境DNA分析技术在海洋鱼类检测灵敏度上显著高于传统调查方法。（3）环境友好、对调查对象无损伤[1,9]。eDNA分析技术，需要的是水样、底泥、空气等环境样本，不需要对调查对象进行直接抓捕。水样及泥样的获取，仅需一部采水器或采泥器即可。与拖网作业等调查方法相比，最大限度减少了对调查生境的破坏。

4 环境DNA分析技术的应用

4.1 国外应用现状

近年来，国外已成功将环境DNA技术应用于动植物的多样性监测研究，基于环境DNA技术的水生生物研究文献也越来越多，2016年发表论文近百篇。目前这一技术被广泛应用于生物多样性评价、水生生物监测和珍稀濒危物种保护等研究领域[8-10]。

WILLERSLEV，et al[26]首次利用环境DNA分析法揭示了沉积物中灭绝的植物、哺乳动物及鸟类的物种组成的多样性，标志着环境DNA分析在生物学研究中的应用从低等的微生物扩展至高等的动植物。2008年FICETOLA，et al[7]将这一技术引入水生生物研究领域，利用水中提取的DNA来监测美国牛蛙Rana catesbeiana的分布状况，开启了水生生物实时监测应用研究。THOMSEN，et al[27]首次尝试利用环境DNA技术对研究水域中某些濒危物种生物量进行估测。随后JERDE，et al[24]利用水样环境DNA分析法监测了密歇根湖及其周边河流中鲢Hypophthalmichthys molitrix和鳙H.nobilis的扩散趋势，结果表明这2种入侵鱼的分布范围已经超出了传统调查法划定的区域，为入侵物种的治理工作提供了准确的位置信息和预警资料。2013年，TAKAHARA，et al[28]利用eDNA技术追踪入侵物种—蓝鳃太阳鱼Lepomis macrochirus在日本本土及周边岛屿的扩散趋势，发现环境DNA研究结果优于传统资源调查结果。2015年，SIGSGAARD，et al[29]利用环境DNA分析技术，成功地从传统分布区内检测到了欧洲泥鳅Misgurnus fossilis的踪迹，为物种保护补充了重要的地理分布信息。

2016年，SIGSGAARD，et al[30]利用环境DNA技术开展了世界上体型最大的鱼类—鲸鲨Rhincodon typus的种群遗传学研究，推算育龄雌性鲸鲨的数量约有71000头，并认为出没在埃尔沙辛油田海域的鲸鲨种群和印度洋—太平洋种群更为接近，该研究结果被评价为具有划时代意义的“概念性进步”，“将环境DNA的研究推上了一个新高度”。DOI，et al[31]研究了佐波川河环境DNA浓度与香鱼Plecoglossus altivelis的生物量关系，结果发现环境DNA技术是评估香鱼生物量及其空间分布的有效手段。近几年，人们也开展了两栖类[32-34]、甲壳类[35-36]、软体动物[37]等水生动物研究，进一步证实了环境DNA研究的有效性和可靠性。

除了用环境DNA定量检测特定物种外，THOMSEN，et al[27]通过metabarcoding测序技术，对欧洲多国淡水系统的濒危水生动物（鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类、昆虫）进行多样性检测，研究结果一方面支持环境DNA在水体环境的广泛分布性，另一方面证明metabarcoding技术对不同生物分类群具有普遍适用性，能够可靠用于珍稀和濒危物种监测。YAMAMOTO，et al[25,36]通过日本海舞鹤湾鱼类分布和环境DNA关系分析，结合网格化调查和声学评估手段，得出表层水体环境DNA浓度与生物量调查结果呈显著正相关的结论，认为环境DNA浓度不仅可反映竹荚鱼Trachurus japonicus生物量，而且在海洋鱼类多样性检测灵敏度、结果可信度等方面均显著高于传统调查方法。

4.2 国内应用探讨——以舟山渔场为例

国内关于环境DNA技术研究水生生物的研究很少，仅有三例相关报道[8-9]。马竹欣[38]采用环境DNA技术监测了克氏原螯虾Procambarus clarkii在元阳梯田的分布状况和扩散动态，为这一外来入侵物种的防控提供了决策依据。徐念等[39]开展了长江中下游干流环境DNA分析工作，共获得了10种鱼类序列，为长江水生珍稀濒危物种监测和多样性评价提供了基础依据。姜维等[40]开展了以川陕哲罗鲑Hucho bleekeri为目标物种的水样环境DNA分析流程的优化工作，认为线粒体DNA控制区可作为鉴定川陕哲罗鲑的特异性分子标记。目前，eDNA分析技术在海洋鱼类多样性研究进展十分迅速，而我国相关研究报道几乎是空白。对于典型海域、典型渔场，国内缺乏环境DNA技术的应用研究。

舟山渔场是我国最大的近海渔场，位处长江、钱塘江、甬江等河流的入海交汇区，东部受台湾暖流的影响，西部主要受由三江等大陆径流形成的沿岸水影响，北部还有黄海冷水团的季节性分布，形成独特的水文环境。加上舟山海域上千个岛屿的分布，使其自然环境优越、饵料丰富，是众多经济鱼类、虾蟹类等多种水生动物的产卵繁殖和索饵育肥的好场所[41-42]，也是开展环境DNA技术应用研究的理想水域。虽然舟山渔场鱼类物种丰富、生物多样性高，但围绕鱼类资源的系统研究一直落后于渔业生产。有关舟山海域鱼类的明确记载，最早见于1994年毛锡林、蒋文波先生主编的《舟山海域海洋生物志》[41]，共列出舟山海域鱼类名录317种，对其中68种鱼类的形态、分布、经济价值做了简单描述。此后，其他学者根据新的发现和资料，从不同角度陆续予以了补充。1995年《舟山鱼类多样性调查和渔业区划》（未公开发表）中一共记载了365种鱼类，但未见具体鱼类名录。赵盛龙等[42]根据2000年4月至2005年4月采集的舟山海域鱼类标本，结合标本馆、研究所等现有标本的复查，以及有关文献资料的核查，编著了《舟山海域鱼类原色图鉴》，该图鉴汇集了该海域鱼类467种（其中6种为国内外引进种），并简要叙述了其形态特征、习性、利用和分布。2006年以后，有较多关于浙江沿海鱼类新种和新纪录种的报道。GAO，et al[43]通过形态特征和DNA条形码研究，报道了鱚属鱼类新种—中国鱚Sillago sinica。一些新纪录种如大口鲨Megachasma pelagios[44]、前肛臀棘鲷Paratrachichthys prosthemius[45]、长木叶鲽Pleuronichthys japonicus[46]等也相继在舟山海域发现并描述。2012年4-7月，陈健等[47]在舟山海域采获3种新纪录鱼类—平头竿虾虎鱼Luciogobius platycephalus、日本长鲈Liopropoma japonicum、黑体网鳚Dictyosoma burgeri。同时，历史上舟山渔场曾以盛产大黄鱼Larimichthys crocea、小黄鱼L.polyactis、带鱼Trichiurus lepturus、曼氏无针乌贼Sepiella japonica等四大海产而闻名。但由于捕捞过度和海洋环境污染的加剧，大黄鱼和乌贼资源严重衰退已近枯竭[48-49]。

由此可见，舟山海域到底有多少种鱼类？其资源分布及其特性如何？巨大的捕捞压力和人类活动影响下，鱼类生物多样性受到何种程度的威胁？该海域重要经济鱼种的又有何现状和特点？亟需深入研究。而以往的海洋鱼类多样性研究主要采用围网、拖网、电鱼等传统调查方法。具有目标生物捕获率低、物种鉴别困难、环境破坏性大、调查过程费时费力的缺陷[1-11]。同时，舟山海域有1 390个岛屿，星罗密布的岛屿更大大限制了舟山近海鱼类多样性的常规监测，岛礁密布区常常无法开展鱼类多样性拖网调查。以舟山近海为案例，采用环境友好、采样简便、快速准确的环境DNA分析技术，对鱼类生物多样性及其资源量评估进行研究意义重大。

首先，舟山海域水体泥沙含量高、水体浑浊度大。独特的水文环境导致eDNA的提取具有很大的难度[39]。亟待明确影响环境DNA提取效果的主要因素，确立受河口影响浑水区水样的最适eDNA提取方法。在该海域开展高质量eDNA的提取方法的探索实验，具有很大的代表性和针对性。可采用沉淀和抽滤等方法相结合的方式获取海水中的eDNA，同时采集底泥来获取底泥中eDNA，通过控制变量和多重交叉方案同步进行，探索舟山近海水样eDNA提取过程中关键环节，并对提取的水样环境DNA进行核酸定量分析，结合绝对定量PCR检测，确定适用于舟山近海的高质量环境DNA提取方法[13-14]。

其次，大黄鱼、小黄鱼、带鱼和墨鱼（曼氏无针乌贼）曾为舟山渔场的四大渔产[48-49]。20世纪70年代以来由于大批机动渔船轮番滥捕等原因，先后出现生长型和补充型群体数量减少过度，典型经济鱼类资源严重衰退的现象[48-49]。基于环境DNA技术对特定海洋鱼种的生物量监测工作在国内还处于萌芽期。若能结合养殖场的大、小黄鱼、曼氏无针乌贼等物种的繁育工作，对养殖水体eDNA进行实时定量分析，通过eDNA拷贝数与物种丰富度或密度进行回归关联分析，进一步建立实验室水体eDNA浓度与生物量或丰度关系模型，并结合野外鱼类多样性调查数据对模型进行有效性验证分析，则不仅有望定量评价四大渔产资源丰度及其在舟山岛礁海域时空分布，同时可为其他物种的生物量相关研究提供技术参考。

最后，环境DNA metabarcoding技术在时间和资金成本上优于传统调查方法，在减少海上调查成本、克服普通PCR和定量PCR只能对单一物种检测的同时，不仅对水体中的全部海洋生物可进行同步检测，还可以从种群密度很低的环境样本中灵敏地检测到物种的存在，增加发现新种、隐存种或者稀有物种的可能性，为生物多样性保护和管理工作提供更为客观、全面的本底资料[3-12,24-25]。采用环境DNA metabarcoding技术，开展海洋生物多样性及时空分布监测，进行舟山海域鱼类的准确、快速鉴定，可实现对舟山近海水生生物的有效调查，简便且高效地阐明其生物多样性（包括种类组成和生物量分布）。结合不同季节的鱼类资源海上大面调查，双向验证舟山海域鱼类的多样性及其时空分布状况。如果同步采用GIS技术，则能更好地实现监测和评价工作，建立一套完善的近海河口生物eDNA metabarcoding分析流程。研究结果不仅可以探索适用于舟山岛礁海域渔业多样性的环境DNA调查方法，为现有监测研究提供新的技术手段，也将为后续鱼类多样性调查评估及其保护管理提供技术支撑。

5 环境DNA分析技术展望

与传统生物多样性研究方法相比，环境DNA技术具有环境友好、灵敏度高、省时省力、对调查对象无损伤等优点。环境DNA分析技术应用于近海鱼类多样性评估，不仅能够更全面地揭示鱼类多样性及其时空变化规律，评估重要经济鱼种生物量的时空分布，发现并描述新发现种类，为鱼类多样性的持续利用、保护与管理提供基础资料，也将为其他水生生物资源调查研究提供参考，具有重要的实践意义和良好的应用前景。

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