CAR-T细胞免疫疗法的研究进展

荣 斌，原 野，吴纯启，李晓旭，王全军*

（1.昆明医科大学公共卫生学院，云南 昆明 650504；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒物药物与毒理学国家重点实验室，国家北京药物安全评价研究中心，北京 100039）

嵌合抗原受体（CAR，Chimeric antigen receptor）-T细胞免疫疗法是一种肿瘤过继细胞免疫疗法，基本原理是利用基因工程修饰T淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体，以非MHC（major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）限制性的方式杀伤肿瘤细胞。CAR的优点在于能非MHC依赖性识别肿瘤蛋白质和脂类抗原，不需要经过抗原递呈细胞（antigen-presenting cell，APC），目前已经发展到第四代，早期主要用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），慢性淋巴细胞性白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤[2]，近年来也用于治疗实体瘤、HIV等。虽然CAR-T细胞在临床试验中取得了显著的效果，但同时也出现了诸多安全性问题，包括细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和脱靶效应等[3]。

1 CAR-T细胞免疫疗法及原理

1.1 CAR-T设计原理

正常T细胞的活化有赖于双信号：第一信号由TCR识别APC表面的抗原肽-MHC复合物（p-MHC）启动；第二信号由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用启动（即B7/CD28协同刺激信号）[4]。而CAR-T细胞技术的设计原理是使T细胞不需要依赖MHC分子和APC，将识别肿瘤相关抗原（TAA）的单链抗体（scFv）、跨膜的共刺激结构域（如CD28和CD4-1BB）和T细胞的活化基序结合为一体，通过基因转导的方法转染T淋巴细胞，经基因修饰的T细胞通过表达单链抗体增强结合肿瘤细胞的能力，同时激活T细胞，使其增殖并激活其细胞毒活性，使其能特异性地识别和杀伤肿瘤细胞[5]。

1.2 CAR结构

CAR基本结构（即第一代CAR结构）包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域是由单克隆抗体的重链和轻链的抗原结合区组成的单链可变片段（scFv），能够识别特定的肿瘤抗原；跨膜结构域有CD4、CD7、CD8、CD28 和 CD3ζ等蛋白分子；胞内结构域为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc 受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），可发挥信号转导功能[6]。

随后的CAR大多遵循相同的结构模式，第1代CAR在胞内只有1个T细胞CD3ζ受体的信号区；第2代CAR增加了1个共刺激分子信号〔如CD27、CD28、OX40、可诱导共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）或CD137（4-1BB）等〕，可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力；第三代增加了2个共刺激分子信号，相比第二代，可使T细胞持续活化增殖，增强杀伤肿瘤细胞作用。目前，用于临床治疗研究的主要为第2代和第3代CAR-T细胞技术，其中用来携带CAR的载体主要来源于逆转录病毒和慢病毒。第四代CAR（或TRUCKs）在前三代的基础上增加了一个或多个可以编码CAR及其启动子的载体，在T细胞激活时可以产生高水平的细胞因子（如IL-12），从而调节局部微环境并辅助CAR-T细胞功能。

1.3 CAR的表达

外源基因导入细胞中通常需要运输工具，因此，将CAR基因整合到T细胞中（即转染）使其成功表达于T细胞表面需要借助特殊的方法，包括病毒法和非病毒法[7]。病毒类载体如复制缺陷的逆转录病毒（γ逆转录病毒或慢病毒）可以通过病毒整合酶的作用，将其逆转录到T细胞DNA中，从而成为该细胞基因组的一部分。但是，由于良好操作规范下的逆转录病毒生产耗费时间且费用昂贵，因此有些研究小组采用非病毒转导的方法来实现永久性转导，如采用特定的基于转座子的系统，包括“睡美人”（Sleeping Beauty，SB）转座系统[8]和piggyBac（PB）转座子[9]。但是，通过这些方法成功表达CAR的T细胞需要在体外扩增到足够的数量才能输入体内产生治疗效果。

2 CAR-T细胞免疫疗法的临床应用

过继性免疫效应细胞治疗（adoptive cell transfer therapy，ACT），是指从肿瘤患者中分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者转输，从而直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。ACT包括非特异性免疫治疗和特异性免疫治疗，CAR-T细胞免疫疗法属于后者。接受CAR-T细胞免疫疗法的患者，需要从其体内分离免疫T细胞，利用基因工程将CAR表达于T细胞；然后进行体外培养，大量扩增CAR-T细胞，一般一个病人需要几十亿，乃至上百亿个CAR-T细胞；最后把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内，严密监护病人。

2.1 CAR-T细胞免疫疗法在B细胞淋巴瘤中的应用。

2.1.1 非霍奇金淋巴瘤

CAR-T细胞免疫疗法的早期临床试验主要集中在治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）。贝勒医学院（BCM）、希望之城和弗雷德哈钦森癌症研究中心（FHCRC）[7]等研究团队和Memorial Sloan Kettering癌症中心（MSKCC）的研究组[8]以及Savoldo等人[9]证明了用靶向CD19的含有CD28共刺激结构域的第二代CAR-T细胞免疫疗法治疗慢性淋巴细胞性白血病（CLL）或滤泡性淋巴瘤取得了较好的疗效，且第二代CAR明显促进了T细胞的扩增、增强了T细胞持久性。尽管总体疗效较好，但偶尔出现的毒性反应如细胞因子释放综合征（CRS）说明CAR-T细胞免疫疗法需要进一步评估。

近两年的各项研究正逐步改善早期临床试验中治疗NHL出现的各项问题。在FHCRC研究人员的最新一项临床试验中[9]，34名复发/难治性NHL的患者接受19BBz CAR治疗。绝大多数患者有弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL，n=18），其余为滤泡型淋巴瘤（n=6），CLL（n=6）或套细胞淋巴瘤（n=4）。注入的CD19 CAR-T细胞具有确定的亚群，即比例为1:1的CD8+T中央型记忆细胞与CD4+T细胞。他们还比较了用环磷酰胺＋氟达拉宾或环磷酰胺（没有氟达拉宾）的预处理方案，结果显示：用氟达拉滨和环磷酰胺治疗的患者中，CAR-T细胞的持久性和扩增性增加，且与仅用环磷酰胺治疗的患者相比，CR率得到改善。在由FHCRC治疗的最佳预处理方案的队列中，DLBCL的CR率为38%（3/8），滤泡性淋巴瘤的CR率为67%（2/3）。此外，CLL的CR率为50%（n=3/6），表明CLL早期试验的结果得到改善，最有可能的原因是改善了调节化疗。他们还证明了由于细胞介导的抗鼠scFv T细胞应答导致CAR T细胞持续性差的潜在原因。因此，在调节化疗中加入氟达拉滨的益处是使对CAR的宿主T细胞免疫应答最小化。UPENN研究人员在由Kite Pharma赞助的I/II期临床试验中[11]再次证实DLBCL对19-28zCAR-T细胞敏感。

自从首次报道针对非霍奇金淋巴瘤的CAR-T细胞免疫疗法的8年以来，诸多研究小组经过不懈努力，他们的累积研究工作已经确定了一个更优化的的调理化疗方案、有效和安全的CAR-T细胞剂量范围以及最佳的CAR设计方案。尽管取得了这些成功，但其他类型的NHL仍然有更多的工作要做，比如CLL。由于不适宜的肿瘤微环境，这种疾病可能对免疫干预更具抵抗力，或者来自这些患者的T细胞可能比其他B细胞恶性肿瘤持续受损更严重，需要进一步优化预处理方案。

2.1.2 B细胞急性淋巴细胞白血病

国内对CAR-T细胞免疫疗法治疗急性B淋巴细胞白血病的研究取得了巨大进展。根据第三军医大学新桥医院血液科的临床观察[12]，2015年4月～2016年1月期间，3例复发/难治性急性B淋巴细胞白血病患者采用CAR-T细胞治疗。3例患者均为多次诱导化疗不能达到完全缓解，或复发后再次诱导治疗无效。均采集自体外周血T淋巴细胞进行转染、培养。回输前以氟达拉滨+环磷酰胺方案预处理，回输CAR-T细胞数量为0.97至1.0×106/kg。结果2例患者在CAR-T细胞输注后1月内达到完全缓解，1例患者无效。达到缓解的2例患者在CAR-T细胞治疗后的第3和第6个月复发。复发后的1例患者出现CD19阴性克隆复发；在整个治疗过程中，未发生严重的不良反应。因此得出结论：CAR-T细胞可以有效的治疗复发/难治CD19抗原阳性急性淋巴细胞白血病，能够降低耐药患者体内肿瘤负荷，甚至达到完全缓解。

2.2 CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤中的应用

CAR-T细胞免疫疗法在治疗血液肿瘤方面取得了显著的成功，尤其是CD19-CARs在治疗急性和慢性B淋巴细胞白血病和患有淋巴瘤和恶性肿瘤的患者的临床试验中均显示出良好的治疗效果。目前越来越多的临床试验集中在实体瘤，靶向表面蛋白包括癌胚抗原（CEA）、糖基化血红蛋白GD2、间皮素、白细胞介素13受体α（IL-13Rα）、人表皮生长因子受体2（HER2）和（FAP）和L1细胞粘附分子（L1CAM）等。

2.2.1 神经母细胞瘤

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外实体瘤，主要起源于肾上腺，NB发病早、恶性程度高、预后差，传统的手术切除、放疗、化疗以及造血干细胞移植等多重疗法介入，NB患儿总体生存率已有所提高，但高危患儿临床预后仍不佳，因此CAR-T细胞免疫疗法有望成为较好的治疗备选方案。

神经节苷脂GD2作为肿瘤相关糖类抗原，与肿瘤的增殖、扩散、血管生成、代谢、免疫相关。研究发现，GD2在神经母细胞瘤组织中呈高密度表达，而在其他神经源性肿瘤低密度表达，因此GD2-CAR-T细胞免疫疗法已在临床试验中作为治疗神经母细胞瘤的最佳方案。Chrystal U. Louis等合成了GD2-CAR-T细胞治疗神经母细胞瘤患者，且在EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（EBV-CTL）和活化T细胞（ATC）中表达了两种可以区分形式的CAR，在之前的研究中他们已证实：表达GD2-CAR（CAR-CTL）的EBVCTL在灌注早期比GD2-CAR ATC（CAR-ATC）有更高水平的传播。在他们最新的研究中，报道了19例高危神经母细胞瘤患者输注GD2-CAR-T细胞的长期临床和免疫学结果：输注缓解8例，活动性疾病11例。11例活动性疾病患者中有3例完全缓解。因此，GD2-CAR-T细胞免疫疗法治疗神经母细胞瘤效果良好。

2.2.2 恶性黑色素瘤

恶性黑色素瘤（malignantmelanoma）是起源于胚胎期神经嵴的恶性肿瘤，其恶性度极高，预后差，以皮肤恶性黑色素瘤最常见。针对恶性黑色素瘤的手术治疗，即使进行早期进行根治手术，患者5年生存率也低于70%，晚期患者5年生存率仅5%-10%。因此，越来越多的科学家将关注点放在CAR-T细胞免疫疗法应用于治疗恶性黑色素瘤上。

黑色素瘤携带大量突变基因，其表达的肿瘤新抗原可以被患者的适应性免疫系统识别，因此近年来新抗原被确定为潜在靶标。在Efrat Merhavi-Shoham等科学家进行的ACT治疗恶性黑色素瘤试验[13]结果中显示：使用VEGFR2-CAR-T细胞的ACT的24名患者中，缓解率为4%。目前正在进行GD2-CAR-T细胞治疗黑色素瘤的I期临床试验。

3 CAR-T细胞免疫疗法的毒性

3.1 肿瘤靶向毒性

造成肿瘤靶向毒性的原因是携带CAR的T细胞快速、大量增殖，导致细胞内的炎性细胞因子短时间内迅速释放，造成细胞因子释放综合征（cytokine-release syndrome，CRS），症状以寒颤、发热为主。同时，由于CAR成功结合肿瘤细胞上的靶抗原，导致肿瘤细胞内容物大量释放，从而造成以高钾、高磷、高尿酸、低钙症状为主的肿瘤溶解综合征（Tumor lysis syndrome，TLS）[14]。第二代CD19-CAR-T细胞临床试验中，患者出现发热、低血压、谵妄现象等症状，可能与T细胞介导的炎症、释放大量炎性因子(如IL-6)有关[15]。

3.2 非肿瘤/靶向毒性

CAR识别的抗原多为肿瘤相关抗原（Tumor associated antigen，TAA），而肿瘤相关抗原并非肿瘤细胞所特有，其在健康组织上也存在不同程度的表达。这种CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时也会攻击正常组织造，这种毒性即非肿瘤靶向毒性，该毒性机制造成的毒性效应称为脱靶效应。Beatty等科学家在治疗恶性胸膜间皮瘤、转移性胰腺癌的临床试验中表明，脱靶效应可造成患者心脏骤停、呼吸衰竭、等副反应，原因是间皮素可在正常腹膜、胸膜及心包间皮细胞上表达，CAR识别了正常组织、细胞上的间皮素并且对其产生杀伤作用，导致较为严重的后果。

3.3 非肿瘤/靶向外毒性

顾名思义，该毒性即CAR-T细胞对健康组织、非靶向抗原造成的毒性。该毒性机制最近出现在CAR-T细胞疗法的试验模型中，其原理是CAR-T细胞发生效应后T细胞的活性持续下降且存在于体内时间较长，从而间接影响体内局部微环境，导致细胞稳态失调，引起毒性效应[16]。Kalaitsidou M等科学家报道了接受CD19靶向的第二代CAR-T细胞治疗的小鼠出现了Th1型的细胞因子驱动的急性毒性，同时报道了由于CD4+CAR-T细胞的慢性活性造成的骨髓细胞响应于Th2型细胞因子驱动的慢性毒性，这种慢性毒性导致髓样细胞的特异性扩增。最终尸检证明，受影响的动物呈现脾肿大，淋巴结充满肉芽肿样细胞；细胞因子分析显示Th2细胞因子水平升高，特别是IL-10和IL-1，并且假定该细胞因子来源于在次级淋巴结结构内鉴定的大量CD4+CAR T细胞。然而受影响的动物基本上没有CD8+CAR-T细胞和B细胞，因此这项研究最终证明了CAR-T细胞长期在体内长期刺激时会存在自身毒性的潜能。

4 结 语

CAR-T细胞免疫疗法作为近期内最热门的研究领域，FDA在2017年分别受理了诺华和凯特制药CAR-T疗法的生物制品申请，同时，全球第一个CAR-T疗法上市；该疗法早期主要集中于治疗淋巴瘤和白血病，近年来在治疗黑色素瘤、卵巢癌、神经胶质瘤等疾病的临床试验中也取得了巨大进展，在肿瘤的过继细胞免疫治疗方面有着有人的前景。

针对出现的一系列包括细胞因子释放综合征、脱靶效应在内的较严重的不良反应，国内外科学家也研究出诸多应对措施，如导入自杀基因、构建抑制性CAR、构建双靶抗原CARs、改变T细胞输注途径等[17]。目前最常用的就是导入“安全开关”（自杀基因），导入自杀基因即在CAR内导入一个共表达的自杀基因，当CAR-T细胞增殖且发挥效应过快时激活自杀基因，诱导CAR-T细胞凋亡，从而终止治疗[19]。常见的自杀基因有诱导型半胱天冬酶9（iC9）基因[18]、编码单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）[20]。Lihua E. Budde1、Carolina Berger等人的研究团队激活已用iC9自杀开关证明导入自杀基因的CAR-T细胞在体外和体内均能有效除去转导的T细胞，该工作证明了以安全和更有效的方式治疗CD20+恶性肿瘤的方法的可行性和前景，并且该研究团队计划进行这种方法治疗复发性无痛性B-NHL的I期临床试验[21]。

综上，在短短几十年内，CAR-T细胞免疫疗法从二十世纪八十年代晚期首次被人们提出作为一种抗癌策略，到近几年变成了可实际操作的方案治疗难治且致命的肿瘤，彰显出这一领域的光明前景。在国内外科学家的努力和创新下，CAR-T细胞治疗技术必将成为众多恶性肿瘤患者的福音。