肠道菌群失衡对急性胰腺炎发生发展的影响及意义

何丛 祝荫 吕农华

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症，其发病率呈逐年增高趋势。重症AP(SAP)早期，由于炎症细胞因子大量释放可引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，后期可并发肠功能障碍和胰腺坏死组织感染(infected pancreatic necrosis，IPN)。IPN的感染细菌大多为肠道细菌，如常见的大肠杆菌、粪球菌和肠球菌等，肠源性感染可能是SAP患者发生IPN的始动因素。近年来，肠道菌群作为人体的第二大基因组，与人类健康和疾病的关系受到人们的广泛关注。正常肠道菌群参与人体多种生命过程，在肠道发育和稳态、肠道免疫系统的建立及防御病原体入侵等多种生理过程中发挥着重要作用。

一、肠道菌群在AP中的改变

2015年Tan等[1]首次应用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳法(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)分析发现，与轻症AP(MAP)比较，SAP肠球菌相对丰度明显升高，而乳酸杆菌丰度明显下降，肠道菌群变化越显著的SAP患者MODS和感染性并发症的发生率越高，且血清炎症因子IL-6水平与肠杆菌科和肠球菌丰度呈正相关而与乳酸杆菌呈负相关，血清内毒素水平与肠球菌呈明显正相关，提示炎症反应可能与肠道菌群失衡有关。Chen等[2]建立急性坏死性AP(acute necrotizing pancreatitis，ANP)动物模型并应用16S rRNA高通量测序法研究肠道菌群的改变，同时检测回肠中潘氏细胞抗菌肽分泌。主成分分析(principal component analysis，PCA)显示ANP组肠道菌群结构与正常对照组存在显著差异，其物种多样性明显减少，门水平表现为Saccharibacteria和Tenericutes减少，属水平表现为大肠埃希菌-志贺菌和Phascolarctobacterium相对丰度明显增加而Candidatus_Saccharimonas、Prevotellaceae_UCG-001、Lachnospiraceae_UCG-001、Ruminiclostridium_5和Ruminococcaceae_UCG-008则明显下降。与此同时，潘氏细胞分泌的抗菌肽明显减少，且与大肠埃希菌-志贺菌丰度呈负相关，提示ANP肠屏障功能的破坏可能与肠道菌群失衡以及潘氏细胞抗菌肽的减少有关。Huang等[3]在高脂血症性ANP动物模型中同样发现肠道菌群失衡与潘氏细胞抗菌肽的减少，两者呈显著的相关性，进一步证实不同病因ANP均存在肠道菌群失调及其与肠屏障功能障碍有关。

由于应用PCR-DGGE法分析肠道菌群结构灵敏度较低，仅能检测肠道中高丰度微生物，具有一定局限性。我们团队采用目前灵敏度较高的16S rRNA高通量测序法，检测130例不同病情分级的AP患者(包括41例MAP、59例MSAP和30例SAP)及35例正常人肠道菌群结构，分析两者的差异，同时建立AP动物模型，从AP患者和动物模型两个层面研究AP对肠道菌群的影响及其与肠屏障及炎症反应的关系。研究结果显示AP患者肠道菌群组成发生显著改变，其物种多样性明显减少，并且通过建立数学模型分析发现35种细菌改变与AP显著相关，其预测敏感性达84%。而且这些细菌的改变与炎症反应及肠屏障受损有关。进一步比较发现AP患者和动物模型中肠道内机会致病菌(如大肠埃希菌-志贺菌、肠球菌和某些肠杆菌)相对丰度均明显增加，而维持肠黏膜屏障的有益菌属则明显减少，由此推测AP早期肠道菌群的失衡可能破坏肠屏障，使肠道内致病菌通过损伤的肠黏膜释放入血，导致细菌易位从而继发肠源性感染。因此，肠道菌群失衡可能是促进AP病情进展和后期并发症发生的重要因素，但其因果关系及确切的分子机制有待进一步深入研究。

二、肠道菌群失衡促进AP进展的可能机制

1．肠道菌群稳态被打破从而影响肠黏膜屏障功能：肠黏膜屏障包括机械屏障、免疫屏障与生物屏障。机械屏障由肠上皮细胞、细胞间紧密连接和上皮表面的菌膜三者共同构成，能有效阻止肠腔内细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜进入血液。肠道正常菌群如Lactobacillus sakei OK67可通过增加结肠肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达修复肠黏膜机械屏障，抑制炎症反应。Zhu等[4]报道，给予黄连素的小鼠通过增加肠道内有益菌Akkermansia促进肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，使肠黏膜黏液层增厚从而维持肠屏障功能。肠道菌群还可促进肠上皮细胞的增殖和分化。研究发现，鼠李糖乳酸杆菌GG分泌的p40蛋白可反式激活肠上皮细胞表皮生长因子受体(EGFR)，从而抑制肠上皮细胞的凋亡，保护肠屏障功能[5]。生物屏障主要由正常的肠道菌群构成，形成一个对抗病原体的重要保护屏障，具有影响肠道运动、调节宿主免疫、加强上皮屏障的功能。肠道内有益菌还可直接与致病微生物相互作用，通过替代、排斥和竞争机制抑制致病菌生长和黏附定植；或通过空间位点和营养竞争等阻断其对肠黏膜破坏和血行转移，发挥抗感染作用。我们前期的研究发现AP患者肠屏障功能指标即血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸水平明显升高；AP动物模型的肠道紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达明显下降，均提示存在肠屏障功能受损。Li等[6]在AP患者血液中检测到大肠杆菌、志贺菌等的DNA，进一步证实肠道内机会致病菌可通过破损的肠屏障进入AP患者血循环，从而加重疾病的进展和感染性并发症的发生。

2．肠道菌群代谢产物失衡从而影响肠黏膜屏障功能：短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)大多由肠腔内未经消化的碳水化合物等经肠道菌群酵解产生，包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs对宿主具有氧化供能、抗炎抗肿瘤和维持肠黏膜屏障的功能，可以增加跨上皮电阻和紧密连接蛋白表达，从而加强肠黏膜屏障功能，降低肠黏膜通透性和细菌易位，避免或减轻病理反应。初级胆汁酸在肝脏中合成，随胆汁进入肠道，在肠道产胆盐水解酶细菌的作用下解离和脱羟基分解为次级胆汁酸。胆汁酸一方面可以帮助消化膳食脂质，另一方面可以作为信号分子激活特异受体TGR5和FXR维持肠黏膜屏障的完整。有研究显示，TGR5基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，结肠紧密连接蛋白Occludin表达下降，导致肠黏膜通透性增加[7]。另有研究报道，FXR激活剂奥贝胆酸通过上调胆汁淤积性肝损伤大鼠回肠中紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin表达，从而保护肠黏膜屏障、阻止细菌易位、减轻肠道炎症[8]。内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜上的一种脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和微量蛋白质的复合物，LPS是其主要抗原性和致病性部分，是细菌死亡或解体后释放出来的一种具有广泛生物活性的细菌结构成分。SAP时肠道菌群失衡特别是致病菌大量生长、繁殖并释放大量内毒素，不但可以直接引起肠黏膜屏障损伤，也可引起肠源性内毒素易位，从而导致炎症递质大量释放，最终引发SIRS和MODS。目前在AP发生发展过程中肠道菌群代谢产物的改变及其对肠黏膜屏障、后期并发症的影响尚不明确，有待进一步研究。

三、调节肠道菌群在AP治疗中的作用

通过应用益生菌纠正肠道菌群失衡治疗AP一直是近年来的研究热点，一方面益生菌可维持肠道微生态平衡，增加内在的防御屏障；另一方面益生菌能改善肠黏膜的免疫防御屏障，从而防止肠道产生过度炎症反应。2002年来自匈牙利学者首次针对益生菌乳酸杆菌治疗AP疗效进行了一项随机双盲对照试验，结果显示益生菌治疗组患者感染性胰腺坏死、胰腺脓肿等感染性并发症的发生率显著低于对照组，提示益生菌在一定程度上可改善AP的预后[9]。然而2008年《Lancet》发表了一项来自荷兰的为期4年的PROPATRIA多中心随机双盲对照研究却得出相反的结论，发现预防性应用益生菌反而增加SAP患者的死亡风险，而感染性并发症的发生率无明显下降。此外，益生菌治疗组中9例患者发生肠缺血，而对照组无1例发生[10]。2016年Bongaerts等[11]对该研究进行重新评估，提出益生菌使用时间晚、剂量低以及治疗前器官衰竭发生率较对照组高可能是益生菌治疗组死亡率高于对照组的原因，建议SAP患者应用益生菌的时机应尽早且剂量需增加(1012-1014CFU/d)，同时限制多糖的摄入，从而防止肠道自身菌群过度生长。

目前，益生菌的安全性主要存在以下几方面问题：(1)益生菌的潜在感染能力。在SAP等危重情况下应用益生菌可能发生益生菌易位并诱发感染和败血症等。(2)益生菌携带的多种酶(如硝基还原酶、氨基脱羧酶和糖苷酶等)产生的毒性代谢产物对机体尤其是胃肠道系统可能产生不利影响。(3)益生菌的免疫效应可能引起超敏反应。(4)益生菌的耐药性。一旦某些潜在致病性益生菌成为致病菌则会增加抗感染治疗的难度。2013年国际胰腺协会与美国胰腺协会制定的AP诊治指南中不推荐使用益生菌预防AP感染性并发症，同年我国AP诊治指南提出益生菌可调节肠道免疫和纠正肠道菌群失调，从而重建肠道微生态平衡。目前粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)通过调节肠道菌群失衡治疗复发性艰难梭菌感染已被写入美国医学指南，此外FMT在治疗溃疡型结肠炎、肠易激综合征和代谢综合征等疾病中也显示出良好的前景，但迄今为止尚无FMT应用于AP的报道。目前美国NIH Clinical trials网站上已注册相关临床研究，对于其临床疗效我们拭目以待。

四、结语与展望

人体肠道菌群作为一个重要的“器官”参与人体生理和病理过程，与人体形成复杂的共生体。目前AP病程中存在肠道菌群失衡，肠黏膜屏障受损，细菌易位导致疾病进展，影响预后较为明确，但肠道菌群紊乱与AP的重症化是否存在因果关系，机制如何还需要更多的实验研究加以证实，而肠道微生态制剂和粪菌移植在AP治疗中的应用也需要更多的临床研究以资明确。

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[2] Chen J, Huang C, Wang J, et al. Dysbiosis of intestinal microbiota and decrease in paneth cell antimicrobial peptide level during acute necrotizing pancreatitis in rats[J]. PLoS One, 2017,12(4):e0176583.DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2017.11.023.

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