糜子特异性SSR标记的开发

王璐琳 ，王瑞云 ，，何杰丽 ，薛延桃 ，陈 凌 ，王海岗 ，乔治军

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031；3.山西农业大学文理学院，山西 太谷 030801）

糜子（Panicum miliaceum L.），又叫黍稷，为禾本科黍属，是我国古老作物之一，在小杂粮作物中占有重要地位，栽培历史悠久[1-2]，具有抗盐抗旱等优良特性[3-4]，由于糜子对各种土壤都有极好的适应能力，所以，在我国北方干旱半干旱地区具有很大的生产优势[5-8]。近年来，随着对小杂粮研究的逐渐深入，糜子的保健功能逐渐被世人认可[9]。不管是对糜子的表观研究还是分子水平的研究，都已成为人们的研究热点。连帅等[10]利用SSR分子标记对国内外糜子地方品种和野生资源的遗传多样性进行了研究；王瑞云等[11]利用荧光SSR对我国糜子的遗传多样性进行了分析。近几年，农业部将糜子列入了产业技术体系，这对于糜子新品种选育、高产栽培技术研究、种质资源的鉴定和优异基因挖掘都具有很好的促进作用。加速开展分子生物学技术在糜子这一作物上的研究应用，对于提高糜子整体研究水平具有重要意义。

SSR标记在分子标记中的应用较为广泛，其原理是：在所有的真核生物基因组中，都存在一类由1～6个碱基序列串联而成的DNA碱基序列，由于等位基因不同而重复数不同，可根据重复序列两侧保守序列设计特异性引物，之后进行PCR扩增，这种微卫星标记序列是由保守序列决定，且有染色体位点的特异性，因此，大多数真核生物的遗传标记来源于此。SSR分子标记技术拥有高度多态信息含量（PIC）丰富的分子标记[12]，即简单重复序列，长度一般较短，广泛的分布在基因组不同的位置[13]。SSR分子标记的共显性好、多态性丰富，因而，成为糜子最实用的检测标记技术。

山西农业大学农学院植物学实验室前期转录组测序获得了70个三碱基重复微卫星标记，本试验基于这些标记设计引物，对来源不同的糜子品种的基因组DNA进行扩增，筛选具有多态性的引物，为糜子资源的遗传差异提供分子检测工具。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究选取来自不同生态区的6份糜子材料（表1），种植于营养钵中，于三叶期剪取新鲜叶片，提取基因组DNA。

表1 6个耐盐性筛选黍子品种的名称、编号、生态栽培区及来源

1.2 试验方法

1.2.1 SSR引物的设计与合成 利用primer5.0设计引物，设计时遵循A碱基不能在3′端出现，上下游引物的退火温度之间相差不要太大（表2）。

表2 引物设计参数

1.2.2 基因组DNA的提取与检测 采用改良后的CTAB法提取糜子全基因组DNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳以及紫外微量核酸仪来检测DNA的质量、纯度和浓度，最后稀释成10倍备用。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系（20 μL）：ddH2O 13.8 μL，dNTPs 1.6 μL，Taq 聚合酶 0.4 μL，前后引物各 0.6 μL，10×buffer 2.0 μL，DNA 模板 1.0 μL。PCR扩增程序为：预变性94℃5 min；变性94℃45 s，退火 50 s，延伸 72 ℃ 1 min，共 38 个循环；后延伸72℃10 min。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 将SSR PCR扩增的产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液10×TBE，电压 200 V，时间 2.5 h，用 AgNO3进行染色，在LED灯光工作台上进行观察并读取特异性条带。

1.3 数据处理

根据电泳结果中有无扩增的条带，有记录记为1，没有记为0，以此方法来记录不同糜子品种在同一引物中的等位点基因的变异情况，然后利用power marker V3.25软件计算各引物的多态性信息含量（PIC），利用Rp＝∑Ib，Ib＝1-（2×|0.5-P|）公式计算引物分辨率（Resolving power，Rp）。其中，Ib表示某个等位基因信息量；P表示某个等位基因在6份材料中出现的频率。

2 结果与分析

2.1 70对SSR引物的多态性筛选

结果发现，70对SSR引物中有67对引物可以扩增出条带（图 1，2），3对引物无扩增结果（图 3）。67对有扩增片段的引物中，17对DNA条带呈多态性（图 2），50对为单态（图 1）。

2.2 17对SSR引物的遗传参数分析

从表3可以看出，17个位点共检测到47个等位变异；每个位点等位变异数为2～4个，平均为2.8个。其中，RYW87 最高，RYW82，RYW92，RYW97，RYW102最低。

17个位点的多态性信息含量（PIC）为0.239 2～0.6713，平均为 0.4321，其中，RYW87 最高，RYW89，RYW92，RYW97，RYW102最低。就PIC值而言，6个位点（RYW86，RYW87，RYW88，RYW91，RYW99，RYW101）大于0.5，为高度多态性位点；7个位点（RYW90，RYW93，RYW94，RYW95，RYW96，RYW98，RYW100）为0.25～0.5，为中度多态性位点；4个位点（RYW89，RYW92，RYW97，RYW102）小于 0.25，为低度多态性位点。

17个位点的基因多样性指数为0.2778～0.7223，平均为0.4902；其中，RYW87最大，RYW89，RYW92，RYW97，RYW102最小。17个SSR的片段大小为175～375 bp，最大为 RYW86，最小为 RYW98。

表3 6个SSR标记的遗传参数

2.3 17对引物的特征参数

表4 17对引物的特征参数

17对多态性引物的分辨率如表4所示。结果 表明，SSR标记的分辨率介于0.333 3～2.333 3，其中，RYW87最高，RYW91，RYW102最低。从图 4可以看出，SSR标记在0～1之间的分布频率为41%，1～2，2～3的分布频率分别为53%和6%。

3 讨论

近年来，随着科研技术的日渐发达，分子生物学在各个行业不断兴起，我国自古以来就是一个农业大国，拥有比较丰富的作物品种资源，丰富的作物品种资源促进了重要基因库遗传改良的建立，奠定了培育优良、高产新品种的坚实物质基础，大大减少了育种家的工作强度，因此，必须深入了解作物的遗传背景和亲缘关系等，有效利用这些丰富的种质资源，为日后育种及品种遗传基础的多样性提供保障。

目前，人们通过形态学标记、细胞学标记、生化标记或DNA分子标记来对物种的遗传多样性进行研究，前3种比较容易受到环境、植物生长发育和人为因素的影响，所以，结果不太准确。而DNA分子标记中，常用的方法有RELP，RAPD，AFLP，SSR和SNP等。其中，SSR以其基因组的丰富度高，遗传表现为共显性，同时对DNA质量要求较低，但其重复性以及多态性水平较高，而且随着近几年高通量测序技术的发展，成本也较低，受到人们的青睐。

HU等[14]首先利用其他物种的SSR标记对我国的糜子进行遗传多样性研究，由于SSR引物的种间差异使得其通用性较低，因此，想要准确对糜子资源进行更为深入的研究，急需开发来自糜子基因组的特异性SSR标记。CHO等[15]通过构建糜子基因组的基因文库，成功开发了25个SSR标记，并在此基础上，HUNT 等[16]、董俊丽等[2]、王瑞云等[11]、连帅等[17]和刘笑瑜等[18]利用上述SSR分子标记评估国外和我国的糜子资源。董俊丽等[2]选用19个SSR标记对来自俄罗斯和中国的96份糜子资源进行分析，结果表明，基因多样性指数和PIC值分别为0.409 7和0.392 0；同时对这些资源进行了遗传结构和聚类分析，结果表明，聚类分析将资源分为3个类群，且2种方法有一定程度的类似，分布与环境有密切的关系。连帅等[17]选用5对SSR引物对5个糜子生态区的40个糜子资源进行多样性分析，共检测出15个等位点基因，平均为3个，遗传多样性指数和PIC值分别为0.76和0.48。刘笑瑜等[18]选用6对SSR引物对来自我国不同省份的40份糜子资源进行遗传多样性研究，共发现20个等位点变异，其中，平均遗传多样性指数和PIC值分别为0.542 6，0.3403。王瑞云等[10]利用15对糜子荧光特性SSR标记对来自我国的132份糜子资源进行遗传多样性分析，共检测到107个等位点变异，幅度在2～14个，平均为7个，基因多样性指数平均为0.529 8，PIC值平均为0.486 4，高于本次试验（0.425 6），其聚类和遗传结构分析发现，结果相似与试材的地理起源有密切的关系。然而这些试材中的PIC值普遍较低且不足的是SSR标记还是较少，对于丰富的糜子资源很难全面准确地进行遗传多样性分析，所以，开发大量来自本物种基因组DNA的SSR标记的需求是极其迫切的，但是碍于当时技术水平有限，无法快速开发出大量SSR分子标记。王瑞云等[19]运用该高基元分子检测系统评估我国糜子资源的遗传差异，结果表明，聚类群组与地理起源相关，其中，北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区遗传多样性最丰富。

SSR分子标记已经在在大豆[20]和棉花[21]等经济作物上广泛应用。本试验通过利用6个不同省份的糜子对70对SSR引物进行多样性筛选，共筛选出17对具有多态性的引物，后续试验将利用这17条引物对更多糜子基因型进行遗传多样性分析，为糜子分子标记辅助育种提供检测工具。

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