基于饲料酵母二次发酵啤酒糟条件响应面优化研究

宾冬梅, 黄河清涛, 易 诚, 伍渡清, 饶力群

(1.衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008;2.湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128;3.燕京啤酒(衡阳)有限公司，湖南 衡阳 421008)

啤酒糟是啤酒生产的残留物质，主要含有纤维素、淀粉及蛋白质[1]等，因含有大量水分则容易产生变质.目前啤酒企业绝大部分作为粗饲料销售，而因为纤维含量过高[2,3]、适口性明显较差，[4]不能完全被养殖户接收，很多企业当作废弃物处置，浪费了资源，还污染了环境[6].为了能够更高效利用啤酒糟，优选出产生纤维素酶的最佳发酵配伍方案，选定发酵菌种.

目前，国内外应用于生产纤维素酶的菌种主要有木霉、曲酶等[7-9]，全球纤维素酶市场中的20%是来自曲霉属和木霉属[10-12].该文以一次发酵的黑曲霉和木霉双菌发酵，以料水比为1∶0.5，黑曲霉比木霉接种量为5∶5的混菌接种20%， 32℃下培养3 d的啤酒糟为原料，以粗蛋白含量为考察指标，使用酵母菌和枯草芽孢杆菌进行第二次混菌发酵，并通过响应面优化得到啤酒糟第二次发酵的最佳工艺，生产蛋白啤酒糟饲料，达到立体开发啤酒糟的目的.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料

新鲜啤酒糟(燕京啤酒(衡阳)有限公司提供)

1.1.2 菌种

饲料酵母AS2.1180(Candida utilis)由湖南轻工研究院提供，枯草芽孢杆菌NO.1(Bacillus subtilis)由湖南农业大学生命科学院实验室提供.

1.1.3 培养基

斜面(平板)培养基：麦芽汁琼脂培养基.

种子培养基：酵母菌使用麦芽汁培养基，枯草芽孢杆菌使用牛肉膏蛋白胨培养基(1 L蒸馏水+20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+5 g氯化钠+0.5 g牛肉膏+20 g琼脂).

发酵培养基：啤酒槽与麸皮的比例为8∶2.

1.1.4 实验试剂

硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、蛋白胨、琼脂、硫酸铜、尿素、无水乙醇，均为分析纯

1.1.5 仪器与设备

电热恒温水浴锅、电热恒温水槽、紫外-可见分光光度计、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温水浴锅、凯氏定氮仪、冷冻高速离心机、粗纤维测定仪、恒温培养摇床、超净工作台、光照培养箱、高压灭菌器等.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养

斜面孢子的培养：将菌株转接到新鲜的斜面试管，于30℃培养3 d.

种子制备：往250 mL三角瓶中倒入150 mL种子培养基，设置115℃灭菌16 min，等待冷却后接入新鲜成熟菌种斜面孢子一环，在摇床中30℃、150 r/min的条件下培养3 d.

发酵培养：取发酵培养基30 g加入到250 mL的烧杯中，在115℃灭菌15 min后，培养条件为含水量2倍，混菌接种20%，其中黑曲霉比木霉接种量为6∶4，在30℃下培养3 d后，再接种一定量酵母菌和枯草芽孢杆菌，在一定温度下培养若干天.

1.2.2 蛋白质测定

粗蛋白含量的检测，使用饲料中粗蛋白的测定方法(GB/T 6432-94).[11]

将带有消化液的管子插入蒸馏装置，其末端要浸入锥形瓶的吸收液内，吸收液用25 mL硼酸，加入2滴混合指示剂，消煮管中加入50 mL氢氧化钠溶液蒸馏至吸收液体积达到100 mL，取出锥形瓶，冷凝管末端的蒸馏水冲洗液流入锥形瓶内.

吸收液的滴定：0.1 mol/L的标准盐酸溶液滴定溶液由蓝绿色变为灰红色.

称0.5 g蔗糖代替试样进行空白测定，消耗滴定液(0.1 mol/L盐酸)的体积不能超过0.2 mL.

计算公式：

式中，V2为滴定试样所需标准酸溶液体积，mL；V1为滴定空白所需标准酸溶液体积，mL；C为盐酸标准溶液浓度，mol/L；m为试样质量，g；V为试样分解液总体积，mL；V3为试样分解液蒸馏用体积，mL；0.0140为每毫克当量氮的克数；6.25为换算成蛋白质的平均系数.

1.2.3 响应面实验方法

Plackett-Burman设计：在前期试验的基础上，选择可能对发酵产物粗蛋白质产生的影响因素，包括菌种比、硫酸铵、时间、尿素、接种量、温度.为了对这6个因素进行全面考察，以粗蛋白质含量作为响应值Y，利用Plackett-Burman设计，观察各因素的主效应和交互作用见表1.

表1 Plackett-Burman设计因素及水平Tab.1 Design of factors and levels for RSM

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计筛选主要的发酵影响因素

Plackett-Burman试验设计及结果见表2，各因素影响的主效益分析见表3.

六股河各河段水质差别较大，在53km河段评价中，①上游河段水质最好，可达到Ⅱ类水质；②中游段一般为Ⅲ、Ⅳ类水质；③下游段受工农业及生活污水影响较大，水质为Ⅴ类。其中，Ⅱ、Ⅲ类水质占评价河长的45%，Ⅳ类水质占评价河长的38%，Ⅴ类水质占评价河长的17%［3］。

表2 Plackett-Burman试验结果Tab.2 Experimental design and result of n=12 Plackett-Burman

表3 各因素影响的主效应分析Tab.3 Main effect of factors

从表中可以看出，影响粗蛋白质含量的主要因子是温度、硫酸铵、接种量，三者在α=0.05水平以下，P<0.05，表明对酿酒酵母和枯草芽孢杆菌混合发酵啤酒糟的粗蛋白质含量有显著影响(置信度>95%，)，其他因素在α=0.05水平上，P>0.05，表明对产物粗蛋白质含量影响不显著.所以以温度、硫酸铵、接种量进入下一步的响应面分析试验[12].

2.2 响应面分析

响应面分析：根据Box-Behnken的中心组合设计原理，对Plackett-Burman试验设计筛选的3个主要影响因素，进行Box-Behnken试验设计，各主要因素的取值水平见表4.

表4 主要影响因素及水平Tab.4 Design of factors and levels for RSM

根据Box-Behnken中心组合设计原理，以粗蛋白质含量为响应值，设计3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验，试验结果见表5.

表5 粗蛋白含量响应值的试验结果Tab.5 Test results of response value of crude protein content

2.3 回归方程的方差分析

根据表5的试验结果，通过 Minitab软件处理将各因素回归拟合后得到回归方程.回归方程方差分析见表6.

表6 回归方程各项的方差分析Tab.6 Anova analysis

2.4 响应面直观分析

从实验所得特定的响应值Y和对应的因素接种量，硫酸铵添加量和温度构成的响应面分析图(见图1).

图 1 接种量、硫酸铵添加量和温度对啤酒糟发酵产蛋白含量影响的响应面Fig.1 Response surface and contour plots for Inoculation quantity,ammonium sulfate and temperature

选用实验得到的最佳条件进行验证试验，3次平行试验得到的平均粗蛋白含量为43.46%，与理论值相差小于1%，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性.其对应的最佳条件为温度33.73℃，接种量16.51%，酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1，添加硫酸铵5.00%，尿素添加量2.00%，发酵时间4 d，理论粗蛋白质含量43.38%.

2.5 各影响因素分析

2.5.1 发酵时间对产蛋白质的影响

在第二次发酵中，使培养基中蛋白质含量增高的是酵母菌的增殖，在前期发酵中，酵母菌以木霉、曲霉等一次发酵产生的还原糖类作为碳源，进行孢子的萌发、菌丝的生长；随着发酵的持续进行，培养基中木霉、曲霉等一次发酵产生的还原糖类逐渐减少，同时随着酵母菌体生物量逐渐增加，在发酵后期由于菌种的老化，反而会影响啤酒糟中的蛋白质含量.

2.5.2 菌液的接种量对产蛋白质的影响

显然，接种量会直接影响产酶结果，接种量过少，菌种生长达到稳定期的时间较长，糖原的消耗增加，后期供酵母发酵的糖原不足，导致生产效率低； 接种量过多，前期糖原消耗急剧增加，会导致后期营养物质供不应求.

2.5.3 温度对产蛋白质的影响

温度是微生物生长的最重要的影响因素之一.各种菌种都有其最相适宜的生长温度.在 0℃以下，菌体生长缓慢甚至处于休眠状态，温度过高可能使其生长繁殖受抑制甚至死亡.混菌发酵中存在多种菌种，每种菌生长发酵的适宜温度又不尽相同.选择合适的温度，使各菌种之间互相补充互相促进，既有利于代谢产物的大量累积，又不会影响微生物自身的生长代谢.但发酵温度过高，易造成杂菌的感染而影响发酵.

2.5.4 硫酸铵的添加量对产蛋白质的影响

微生物生长需要营养物质， 主要的有碳源、氮源、无机盐、水分等.从实验来看，酵母菌以木霉、曲霉等一次发酵产生的还原糖类作为碳源，能满足酵母及枯草芽孢杆菌的孢子的萌发、菌丝的生长及发酵的需要，而氮原明显不足，因此添加的硫酸铵氮源对发酵具有显著的影响.

2.5.5 不同菌种对产蛋白质的影响

实验中，使用了两种不同的酵母菌来对啤酒糟进行第二次发酵，啤酒酵母是实验室优选菌种，饲料酵母是在湖南轻工研究院购买的优质菌种，在通过二次发酵的响应面实验法后，得到了它们各自的最佳发酵工艺，从结果上看，饲料酵母发酵后，产品粗蛋白含量最高，所以最终实验采用饲料酵母.

3 结 论

在以黑曲霉和木霉双菌一次发酵的啤酒糟中，分别添加啤酒酵母与枯草芽孢杆菌、饲料酵母与枯草芽孢杆菌进行二次混菌发酵，并利用响应面进行发酵条件分析优化，结果表明：以饲料酵母和枯草芽孢杆菌进行二次混菌发酵，其对应的最佳条件为温度33.73℃，接种量16.51%，酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1，添加硫酸铵5.00%，尿素添加量2.00%，发酵时间4 d，理论粗蛋白质含量43.38%,表明通过二次混菌发酵能显著提高啤酒糟粗蛋白含量.

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