HPLC法研究根皮素的稳定性

张瑞涛,徐 媛,王庆伟

(第四军医大学唐都医院药剂科,西安 710038)

根皮素是一种被称为维生素P的类黄酮化合物[1-2],是植物次生代谢产物,化学结构为3-(4-羟基苯基)-1-(2,4,6-三羟基苯基)-1-丙酮,包含4个酚羟基,独特的化学结构决定了其强大的抗氧化活性[3-5]。根皮素主要存在于苹果、梨和金橘等水果果皮中[6-9]。现代药理学研究表明,根皮素具有多种生物学活性,对骨质疏松症具有预防和治疗作用,对心血管硬化、高脂血症、肥胖症和阿尔茨海默疾病也有影响[10-16]。

根皮素的不稳定性会影响根皮素的研究、生产和推广应用,这也是根皮素相关制剂在加工和使用过程中一个急需解决的难题。本研究建立了一种简单、灵敏、快速的测定根皮素含量的HPLC法[17-18],系统研究了溶剂、温度、pH值和光照对根皮素稳定性的影响,为研制稳定的根皮素相关制剂提供强有力的理论依据[19-20]。

1 仪器与试药

1.1仪器 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司,VWD紫外检测器)；CP225D型电子分析天平(德国Sartarius有限公司)；HH-1型恒温水浴箱(北京科伟有限公司)；TGL20M型高速冷冻离心机(湖南湘仪有限公司)；UMV-1型多管漩涡混合器振荡器(北京优晟联合科技有限公司)；KH5200DV型超声仪(浙江昆山禾创超声仪器有限公司)；Milli-Q Advantage A10型超纯水机(美国密理博有限公司)。

1.2试药 根皮素(第四军医大学药物化学教研室提供,质量分数>99%)；磷酸(天津科密欧化学试剂开发中心)；磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸(西安市长安精细化工厂)；氢氧化钠(天津恒兴化学试剂制造有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯,美国Tedia公司提供)。

2 方法与结果

2.1根皮素HPLC测定方法的建立

2.1.1色谱条件与系统适用性 色谱柱：Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-水(45∶55)；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量20 μL;流速：1 mL·min-1。 色谱图见图1。

图1HPLC图

1.根皮素。

Fig.1 HPLC chromatograms

1.phloretin.

2.1.2溶液的配制

2.1.2.1磷酸盐缓冲液 取磷酸16.6 mL，加水至1 000 mL使溶解,作为A液；取磷酸氢二钠71.63 g,加水至1 000 mL使溶解,作为B液；取A、B不同体积,混合,精确配制成pH值分别为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的系列溶液。

2.1.2.2对照品溶液 精密称取根皮素对照品10 mg,加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液,即得。

2.1.3线性关系考察 精密称取根皮素10 mg,置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为储备液；取储备液适量,分别稀释成质量浓度为100,50,25,10,2和1 μg·mL-1的系列溶液。按照2.1.1项下色谱条件,进样20 μL,以峰面积为纵坐标y、根皮素质量浓度为横坐标x进行线性回归,得回归方程y=74.680x+10.087,r=0.999 2,结果表明,根皮素质量浓度在1～100 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.4精密度实验 精密吸取根皮素对照品溶液,连续进样6次,每次20 μL,按照2.1.1项下色谱条件进行测定,测得RSD值为1.06%,结果表明，仪器精密度良好。

2.2根皮素影响因素的考察 对根皮素进行强酸(1 mol·L-1HCl)、强碱(1 mol·L-1NaOH)、强光、强氧化(30 mL·L-1H2O2)、高温(100 ℃)破坏,初步结果表明,根皮素在强酸、强光、高温环境下较稳定,在强碱、强氧化条件下不稳定,尤其在强碱下根皮素迅速降解。

2.2.1室温下根皮素在不同溶液中的稳定性实验 取pH 值分别为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的缓冲液及水、0.1 mol·L-1HCl、30 mL·L-1H2O2各100 mL,分别加入根皮素4 mg,超声处理15 min,振荡摇匀,以3 000 r·min-1离心10 min,取上清,过滤,分别在0,1,2,4,6,8,12和24 h取样,微孔滤膜滤过,取续滤液,按照2.1.1项下色谱条件测定峰面积,用标准曲线回归方程计算溶液中根皮素含量,以质量浓度C(μg·mL-1)对时间t作图。见图2。

图2根皮素在室温下的质量浓度变化曲线

Fig.2 The concentration curve of phloretin at room temperature

2.2.235,55和75 ℃下根皮素在不同pH值缓冲液及水中的稳定性实验 实验结果表明,根皮素在碱性条件下降解速度较快,因此实验只考察pH值为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的缓冲液及水、0.1 mol·L-1HCl和30 mL·L-1H2O2中的不同温度的稳定性,取pH值为3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的缓冲液及水、0.1 mol·L-1HCl和30 mL·L-1H2O2各100 mL,分别加入根皮素4 mg,超声处理15 min,振荡摇匀,以3 000 r·min-1离心10 min,取上清液置于EP管中,进行HPLC测定,作为0 h点,其余分别置于35,55和75 ℃的恒温水浴中,分别在0,1,2,4,6,8,12和24 h取样,微孔滤膜滤过,取续滤液,按照2.1.1项下色谱条件测定峰面积,用标准曲线回归方程计算溶液中根皮素含量,以药物残留百分比的自然对数对时间t作图。见图3～5。

由图3～5可知,根皮素的降解曲线基本符合一级动力学方程。按照一级动力学方程,求出不同温度和pH值下的根皮素的降解反应速度常数K值,见表1。

图3根皮素在35℃不同pH值缓冲液中的降解曲线

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.3 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 35 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

图4根皮素在55℃不同pH值溶液中的降解曲线

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.4 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 55 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

图5根皮素在75℃不同pH值溶液中的降解曲线

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.5 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 75 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

表1降解反应速度常数K

Tab.1 The degradation constantK

温度/℃H2OHClH2O2pH3.0pH4.0pH5.0pH6.0pH7.0350.0200.0030.0360.0150.0160.0260.0310.072550.0490.0060.6250.0260.0380.0510.1571.463750.0890.0182.2860.0610.0730.1051.3894.403

根据Arrhenius公式可以求出室温下的降解反应速度常数K,由其可求出降解10%的时间,即有效期t0.9,求得相同pH值以及不同溶液下的直线方程,见表2。

2.2.3室温25 ℃下根皮素在不同溶液中的最大溶解度 分别取各溶液10 mL,置于离心管中,加足量的根皮素,然后超声15 min,振荡摇匀,以3 000 r·min-1离心10 min,取上清液,滤膜过滤,进行HPLC测定,得色谱峰峰面积,以外标法计算各个溶液的质量浓度,实验重复3遍,取平均值。见表3。

表2根皮素水解Arrhenius方程和t0.9

Tab.2 The Arrhenius equation of phloretin hydrolysis andt0.9

项目Arrhenius方程rK(T=298)t0.9(h)H2OLnK=9.1456-4011.7/T0.99680.0133007.900.1mol·L-1HClLnx=9.6078-4773.2/T0.98640.00164664.0030mL·L-1H2O2Lnx=33.224-11194/T0.98420.0130008.08pH3.0LnK=7.8756-3737.9/T0.98740.00940011.20pH4.0LnK=9.1101-4073.8/T0.99890.01000010.00pH5.0LnK=8.4499-3733.1/T0.99840.0170006.22pH6.0LnK=29.344-10146/T0.99280.00900011.60pH7.0LnK=33.708-11112/T0.97440.0278003.78

表3室温下不同溶剂根皮素的最大溶解度

Tab.3 Maximum solubility of phloretin in different solvents at room temperature

溶剂最大溶解度/μg·mL-1H2O47.40.1mol·L-1HCl25.730mL·L-1H2O225.3pH3.013.6pH4.016.5pH5.017.1pH6.022.2pH7.055.34

3 讨论

在影响因素考察实验中,根皮素在强氧化性条件下不稳定,在碱性条件下迅速降解,而其对强酸、强光、高温较稳定。笔者研究了根皮素在pH值为3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的缓冲液及水、30 mL·L-1H2O2和0.1 mol·L-1HCl 中的恒温加速实验以及室温下根皮素在不同pH值缓冲液及水溶液、30 mL·L-1H2O2中的最大溶解度。实验结果表明,根皮素在酸性环境下比较稳定,根皮素在溶液0.1 mol·L-1HCl,pH3.0,pH4.0,水,pH5.0,pH6.0,30 mL·L-1H2O2,pH 7.0缓冲液中的稳定性依次降低,对于根皮素及其相关产品的研究具有重要意义。

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