铁皮石斛优良菌根真菌的筛选

徐 超， 张红岩， 杨鹤同， 席刚俊

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400； 2.江苏省句容市农业委员会，江苏句容 212400)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生草本植物[1]，具有很好的滋阴润肺、抗衰老、抗肿瘤等功效。成年兰科植物与真菌共生形成内生菌根是自然界的一种普遍现象。菌根具有促进植株生长、提高植株对干旱等逆境胁迫耐受能力的作用[2]，但是菌根的这种有益作用是否能够得到充分发挥，决定于菌根真菌能否对宿主植物进行有效侵染以及菌根真菌的作用效果[2-3]。本试验对不同接种处理铁皮石斛的菌根形成状况及其对改善铁皮石斛促生、抗旱能力的作用效果进行比较，进而确定优良的菌根真菌，以期为进一步开展用菌根提高铁皮石斛抗旱能力的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种的培养

供试真菌菌株为JSNL001、JSNL002、JSNL003、JSNL004、JSNL005、JSNL006、JSNL007、JSNL008，由江苏农林职业技术学院生物工程技术中心于2012年6月在野生铁皮石斛植株根部组织内分离得到，并保存在实验室内。将保存的菌根真菌接种到PDA斜面上进行活化；待长满斜面后，转接至液体培养基中，在三角瓶内进行摇床培养，制成液体菌剂；同时将该真菌转接至棉籽壳培养基质中，制成固体菌剂。

1.2 铁皮石斛菌根化植株的培育

2012年8月，选用粉碎的松树皮为育苗基质，进行高温高压灭菌2 h后，装盆待用。将长势基本一致的铁皮石斛植株驯化苗进行盆栽，每盆栽种1丛，每丛5株。菌剂的施用方式分为固体、液体2种处理。将制备好的液体菌剂、固体菌剂分别施用在基质表面。其中固体菌剂的用量为5 g/盆，液体菌剂的用量为10 mL/盆。施用菌剂后，基质相对含水量在60%以上维持10 d，以确保菌丝在基质内成活。对照处理植株(CK)的接种方式如下：以同样的接种方式，将等量灭活菌剂接种于铁皮石斛植株的基质表面。

1.3 铁皮石斛菌根形态结构观察与侵染程度的测定

接种12个月后，用酸性品红染色法检查铁皮石斛菌根的形成状况，并进行显微拍照。在每个处理中随机抽取20株苗，采用显微观察法统计菌根感染率和感染指数。其中，菌根感染率以株为单位进行计算。感染指数的计算方法为每株苗随机选取5条1 cm长根段，共计100条根段，按照以下标准进行分级统计：0级，无根段感染或感染率在1%以下；Ⅰ级，感染根段比例为1%～20%；Ⅱ级，感染根段比例为21%～40%；Ⅲ级，感染根段比例为41%～60%；Ⅳ级，感染根段比例为60%以上[4]。

1.4 菌根对铁皮石斛促生效果的比较

在接种后18个月时，测定不同处理铁皮石斛的苗高、鲜质量，观察接种菌根真菌后各处理植株的生长状况。每个处理测定50株。

1.5 不同处理菌根化铁皮石斛抗旱能力的比较

选取不同处理的菌根化铁皮石斛，统一进行浇水，使每盆植株的基质含水量达到饱和，然后在简易温室内模拟自然胁迫，使水分不断消耗，在胁迫后10、20、30 d测定萎蔫度、萎蔫率。温室内温度为30～35 ℃，空气相对湿度为50%～60%。每个处理50株，设3个重复[4]。

按照以下标准对铁皮石斛的受旱程度进行分级：0级，健康；Ⅰ级，少数叶片出现萎蔫；Ⅱ级，半数叶片出现萎蔫；Ⅲ级，半数以上叶片萎蔫；Ⅳ级，整株萎蔫。按以下公式统计各处理植株的萎蔫度和萎蔫率[5]：

萎蔫率=(萎蔫株数/处理株数)×100%；

萎蔫度=[∑(萎蔫等级×株数)×100]/(萎蔫最高等级×总株数)。

试验结果用SPSS(V13.0)进行分析，不同小写字母表示差异达0.05显著水平。

1.6 铁皮石斛优良菌根真菌的鉴定

根据“1.4”“1.5”节的试验结果进行分析，确定最佳的铁皮石斛菌根真菌。通过形态观察、内转录间隔区(internal transcribed spacer，简称ITS)序列分析等方法，对确定的铁皮石斛优良菌根真菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 不同菌根真菌处理铁皮石斛的菌根化程度比较

表1结果显示，接种不同菌根真菌后，铁皮石斛的菌根感染率均为100%。而菌根感染指数存在较大差异。其中接种JSNL003、JSNL004、JSNL007、JSNL008的植株菌根感染指数较高，分别为91.25、97.50、95.00、96.25；接种JSNL001、JSNL002、JSNL005、JSNL006铁皮石斛菌根感染指数稍低，分别为85.00、81.25、90.00、86.25；CK植株未见菌根化现象。

2.2 铁皮石斛根部组织的菌根化状况检测

接种菌根真菌后，真菌菌丝能够侵入铁皮石斛的根部组织。菌根化与非菌根化植株的根部组织的外部形态没有明显区别，两者之间的主要差异在于根组织内是否有入侵的菌根真菌。铁皮石斛菌根化以后，在根部细胞间隙中能见到菌丝，同时有分布不匀、形状不一、着色较深的菌丝结(图1)，并且经再次分离后，得到了接种菌株。结果表明，接种菌根真菌后，铁皮石斛的根部组织内确实形成了菌根。

表1 各菌根真菌处理铁皮石斛的菌根化程度

注：同列数据后标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

2.3 不同处理菌根化铁皮石斛生长量的比较

本试验结果表明：接种不同菌根真菌对铁皮石斛植株苗高和鲜质量的作用效果存在较大差异。其中，接种JSNL004、JSNL003后，对铁皮石斛的作用效果较为显著，苗高增幅分别为10.94%、10.16%，鲜质量增幅分别为8.78%、6.87%；其次是接种JSNL007、JSNL008的植株，苗高增幅分别为8.59%、10.16%，鲜质量增幅分别为5.34%、3.82%；接种JSNL006的植株效果稍差；而接种JSNL001、JSNL002、JSNL005的植株效果明显较差，接种后均对苗高或鲜质量有不同程度的抑制作用(表2)。综合以上结果可以看出，菌根真菌的作用效果排序依次为JSNL004>JSNL003>JSNL007、JSNL008>JSNL006>JSNL005>JSNL001>JSNL002。

表2 各菌根真菌处理铁皮石斛的生长量比较

2.4 不同处理菌根化铁皮石斛抗旱能力的比较

在干旱胁迫后10、20、30 d分别对不同菌根化铁皮石斛的抗旱能力进行比较，结果(表3)表明，不同菌根化铁皮石斛间抗旱能力存在较大差异。在干旱胁迫过程中，接种JSNL001、JSNL002、JSNL005、JSNL006的植株和CK植株的萎蔫率、萎蔫度均较高，抗旱能力较差；接种JSNL003、JSNL004、JSNL007、JSNL008的植株抗旱能力较强，在干旱胁迫30 d时，虽然萎蔫率也达到100%，但萎蔫度相对较低，分别为 42.4、40.1、43.4、42.3，显著低于其他处理的植株。因此认为，不同菌根化铁皮石斛的抗旱能力排序为JSNL004>JSNL008>JSNL003>JSNL007>JSNL002>JSNL005>JSNL001>JSNL006>CK。

2.5 优良菌根真菌的鉴定

根据前期试验结果，对确认的铁皮石斛优良菌根真菌JSNL004进行鉴定。经过形态学观察，JSNL004的菌落特征如下：在PDA平板上培养，菌丝致密，附于基物表面；正面为白色菌落边缘全缘；反面白色至淡黄色，略有色素沉积(图2)。PCR扩增得到的内转录间隔区(ITS)全序列如下：

5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAG AGAAATCTTTCAACACTGAAAGATCTTTTCCTTTGTGCTGGCT TTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTTAAAATGGTTCGCAAGGG CCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAATTTTTTCTG AACAATTAAACAAAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAAC TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA

TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGA

GGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACACCTAAC

CTTTGGGTTTATGGCGTGGAATTGGAATGCGCCGACTGTCATG

GTTGGCCCTTCTAAAATGTAGTTCTTGGCTGTCACCTAATACA

GCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGGCATTCATTGTCAAATCTTTGG

CTAACATTTGCTCCAGGAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACT

CATTCAAATTTTGATCTGAAATCAGGTAGGGCTACCCGCTGAA

CTTAAGCATATCAATAAGCG-3′。结合形态学鉴定及分子鉴定结果，确定优良菌根真菌JSNL004为接合菌亚门毛霉目伞形霉属矮小伞霉(Umbelopsisnana)。

表3 各菌根真菌处理铁皮石斛抗旱能力的比较

3 结论与讨论

不同菌根真菌对植物的感染率和感染指数影响较大，只有各种菌根真菌与宿主在可亲和的条件下才能侵染成功，亲和力愈强，形成菌根的状况愈好，反之就愈差[6]。本研究表明，接种菌根真菌以后，铁皮石斛能够形成菌根，但不同菌根真菌的感染指数存在较大差异，其中，接种菌根真菌JSNL004、JSNL008、JSNL003、JSNL007的感染指数都较高，均超过90%，这可能与各菌根真菌与铁皮石斛间的亲和力、不同菌根真菌的菌丝活力存在差异有关。宋微等研究发现，促生效果越好的菌根真菌，形成的菌根化植株对干旱胁迫的耐受性越强[7]。在本研究中，随着胁迫程度的加剧，接种JSNL004、JSNL008、JSNL003、JSNL007的铁皮石斛依次表现出较强的抗旱性，这4种菌根真菌对铁皮石斛植株苗高的促生作用均较为明显，但彼此之间对植株鲜质量的影响存在较大差异，其中JSNL004对植株鲜质量的影响最明显。综合不同菌根真菌对铁皮石斛植株的感染指数、促生、抗旱等指标的影响，认为菌根真菌矮小伞霉(JSNL004)为适用于铁皮石斛的优良菌根真菌，可以为今后制备铁皮石斛专用生物菌肥提供参考。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第19卷)[M]. 北京：科学出版社，1999：117.

[2]金 辉，许忠祥，陈金花，等. 铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用[J]. 植物生态学报，2009，33(3)：433-441.

[3]崔 虹，宋希强. 菌根真菌对春石斛幼苗生长发育的影响[J]. 西南林业大学学报，2011，31(2)：20-23，32.

[4]徐 超. 外生菌根提高铁皮石斛抗旱机理研究[D]. 南京：南京林业大学，2010.

[5]徐 超，吴小芹. 菌根化马尾松对干旱胁迫的响应及其内源多胺的变化[J]. 西北植物学报，2009，29(2)：296-301.

[6]孙民琴. 松树外生菌根的合成及其对松树生长与抗性的影响[D]. 南京：南京林业大学，2005.

[7]宋 微，吴小芹. 13种菌根真菌对松苗生长及耐旱性的影响[J]. 林业实用技术，2009(4)：6-8.