土田七茎尖离体快繁技术研究

2018-01-12戚华沙符瑞侃王景飞吕德任

江苏农业科学 2017年24期

潘梅，黄赛，杨珺，戚华沙，符瑞侃，王景飞，吕德任

(海南省农业科学院热带园艺研究所，海口 571100)

土田七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Baker) Craib ex Loesener]是姜目姜科土田七属多年生直立草本植物，植株高20～30 cm，叶基生，披针形，叶面深绿色，叶背绿色或淡紫红色；花序从根茎抽出，10～15朵花聚生于钟状的总苞内，花白色，唇瓣中央具杏黄色斑。花期5—7月，分布于我国海南、广东、广西和福建，生于海拔800～900 m的林下、荒坡荫湿处[1]。土田七株形好，叶美丽可赏，花奇特，根茎具芳香味，是极好的林下地被和盆栽观叶观花植物。目前土田七仍处于野生状态，用根茎进行繁殖，繁殖速度慢。组织培养技术是快速繁育种苗和保护资源最为有效的方法。目前未见有土田七组织培养与快速繁殖的报道，土田七属其他植物的组培快繁也未见有报道。无机盐和植物生长调节剂对植物的离体繁殖有着重要的影响，直接影响到培养物的培养效果。本研究通过比较无机盐和植物生长调节剂对土田七芽增殖及生根的影响，以建立土田七的快速繁殖技术，为其规模化生产提供种苗。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为土田七茎尖，取自海南省农业科学院热带园艺研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒与诱导于晴天取土田七茎段，在流水下冲洗干净，剥去叶片切取带茎尖长约3 cm的小段，用洗洁精液浸泡10 min，清洗后移入超净工作台上，先用75%乙醇振荡30 s，再用0.1% HgCl2浸泡15 min，最后用无菌水冲洗5次。以MS+0.5 mg/L NAA作为基本培养基，设置6-BA 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L共5个处理，切除底部保留带茎尖长约1.5 cm的小段，接入诱导培养基中，每种处理接种25瓶，每瓶接入1个外植物体，培养30 d后，统计芽数。

1.2.2 不同MS无机盐浓度对芽增殖的影响设置5种MS无机盐浓度，即1/4、1/2、3/4、1、3/2倍MS，分别添加6-BA 2.0 mg/L，共5种处理。每种处理接种10瓶，每瓶3个单芽，3次重复，培养30 d后统计芽增殖系数。

1.2.3 不同6-BA与NAA组合对芽增殖的影响以MS为基本培养基，设计6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L)与NAA(0、0.2、0.5 mg/L)不同配比，共15种处理。每种处理接种10瓶，每瓶3个单芽，3次重复，30 d后统计增殖系数。

1.2.4 不同MS无机盐浓度对小苗生根的影响设置4种MS无机盐浓度，即1/4、1/2、3/4、1倍MS，分别添加NAA 0.5 mg/L，共4个处理。将高度约3 cm的小苗接入各处理培养基上，3次重复，培养30 d后统计生根率、株高、平均根数和最长根。

1.2.5 不同生长素及浓度对小苗生根的影响以MS为基本培养基，设置NAA(0.2、0.4、0.6 mg/L)与IBA(0、0.1、0.2 mg/L)的不同配比，以不添加生长素的培养基作为对照，共7种处理。将高度达到3 cm的小苗接入各种生根培养基上，比较根系分化情况。每种处理接种10瓶，每瓶3株，3次重复，30 d后统计生根率、株高和平均根数。

1.2.6 生根苗的炼苗与移栽将培养30 d根系发达的土田七组培苗移入荫棚，炼苗5 d后，取出小苗洗净根部附着的培养基，移入基质中，浇水淋透，适当遮荫保湿，30 d后统计植株的成活率。

1.3 培养条件

材料接入培养基后移入培养室，光照度为1 500 lx，光照时间9 h/d，温度(26±2)℃。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel整理数据，SPSS 19.0软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同6-BA浓度对丛生芽诱导的影响

从表1可知，随着6-BA浓度的升高，诱导芽数呈先升高后降低的趋势。6-BA浓度为1.0 mg/L时，茎尖外植体只是抽长，基部无新芽分化；6-BA为2.0、3.0 mg/L时，平均芽数分别为2.84、2.80个，芽生长正常；6-BA浓度升高到 4.0 mg/L 时，平均芽数下降为2.68个，且芽较短；6-BA浓度增高至5.0 mg/L时，分化芽继续降低，且芽细。可见，诱导丛生芽较好的6-BA浓度为2.0～3.0 mg/L。

表1 不同6-BA浓度对丛生芽诱导的影响

2.2 不同倍量MS培养基对丛生芽增殖的效果

从表2看出，不同倍量MS培养基对土田七丛生芽增殖的影响不同。在1/4～1倍的MS，丛生芽的增殖系数与无机盐的用量成正比，全量MS时，丛生芽的增殖系数最大值，为3.11，当无机盐用量继续增大到3/2 MS时，丛生芽的增殖系数减小，为2.42。从芽的生长情况看，1/4 MS培养基的丛生芽长势较差，芽细小，有少量叶片呈黄色，其中2芽心叶枯死，随着培养时间的延长，黄化叶的数量增多，黄化程度加重；1/2 MS 培养基的丛生芽长势也较差，芽较细小，少数叶片的上半部出现淡黄色斑点，以后叶片出现慢慢变黄；3/4 MS培养基的丛生芽稍粗，叶色绿；MS培养基的丛生芽生长健壮，芽长，叶色绿；3/2 MS培养基的丛生芽也生长良好，叶呈绿色，但芽较MS的略短。从数据方差分析结果看，MS与其他无机盐处理之间的差异达到显著水平，因此，宜选用全量MS进行土田七丛生芽的增殖培养。

表2 不同MS无机盐用量对丛生芽增殖的影响

注：同列数值后不同小写字母表示0.05水平上差异显著。下表同。

2.3 6-BA与NAA配比对丛生芽增殖的影响

从表3可以看出，单独使用6-BA，在0.5～3.0 mg/L范围内，随着6-BA浓度的升高，芽的增殖系数也提高，6-BA浓度达到4.0 mg/L时，芽的增殖系数下降。6-BA 0.5～1.0 mg/L 时，与NAA各组合的芽增殖系数均在2左右，同一6-BA浓度的组合多差异不显著，但丛生芽的生长状况差异较大，不含NAA的培养基中生长的丛生芽粗，基部根很少，而含有0.2 、0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA的培养基诱导的芽较细，根系多。当6-BA为2.0 mg/L时，与NAA配比的2个组合的增殖系数大于单一的6-BA处理，各组合的芽增殖系数在3以上，但3者无显著性差异，其芽生长健壮，基部不同程度地生根；6-BA 增加至3.0 mg/L时，各处理培养基所培养的分化芽增殖系数都较高，6-BA与0.2 mg/L NAA配合时芽的增殖系数最大，达4.32，且芽生长势好(图1)。但当6-BA浓度达到 4.0 mg/L 时，芽的增殖系数反而下降到2.56～3.16，芽的生长势也较差，芽多细小，平均芽高 1.6 cm，不利于后续的生根培养。综合看来，土田七丛生芽增殖的适宜配方是MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖。

表3 生长调节剂组合对芽增殖的影响

2.4 不同倍性MS培养基对再生芽生根的影响

土田七再生芽接入生根培养基中，1/2MS培养基最早发根，5 d 长出新根，1/4MS于培养7 d长根，3/4MS和MS则培养 8 d 后开始长根，培养30 d后4种培养基中的小苗生根率均达到100%。从表4可以看出，1/4MS处理植株的生长表现差，叶片和叶柄黄化，植株较矮小，平均株高只有6.50 cm，根数少，平均每株生根8.11条，诱导的根系也较短(图2)。1/2 MS的植株叶片也有少量的黄化现象(图3)，但生根数最多，达到10.19条，其株高最高，为8.25 cm，这可能与根系早发且多有利于吸收营养从而促进植株的生长有关。3/4 MS和MS培养的植株无明显差异，植株生长势好，叶色绿(图4)，平均株高7.95、8.13 cm，诱导的根数分别为9.31、9.45条，平均根长2.38、2.52 cm，但培养时间延长至45 d后，3/4 MS上的植株叶片叶梢开始变黄，以后逐渐增多，而MS培养的植株60 d后仍为绿色。方差分析结果表明，1/4 MS与1/2MS、3/4MS、MS 3种处理在株高、根数和根间存在显著性差异；1/2 MS的根数显著高于3/4MS和MS，株高和根最长则差异不显著，但1/2 MS植株叶片有黄化现象，说明土田七所需的无机盐浓度较高，1/2 MS无机盐浓度不能满足植株生长需求，以 3/4MS～MS为适宜浓度，从规模化生产成本考虑，宜选用3/4 MS，如延长培养周期，则可选用MS，全量的无机盐浓度可以满足植株较长时间的营养，保证植株的质量。

2.5 不同生长素培养基对再生芽生根的影响

土田七小苗较易生根，在无生长素的培养基中，小苗生根率也能达到100%，但发根较慢，根数少，平均每株生根5.52条，长出的根较短细，植株较矮小，最小株高只有4 cm，平均株高6.48 cm(表5)。含生长素的培养基，植株长势良好，株高最小值为7.21 cm，最高的达到8.16 cm；单一使用NAA，株高与NAA浓度成正比；NAA与IBA 0.1 mg/L配合时，株高值也随着NAA浓度的升高而加大；当IBA 0.2 mg/L时，以 0.2 mg/L NAA时的株高为最大。就生根数量来看，在一定的范围内，植株的根系发生似乎与生长素的绝对值(总含量成正比，在0.2～0.6 mg/L的浓度之间，随着生长素浓度的加大，生根数量增多，0.6 mg/L NAA对根系的发生影响最大，根数达到9.74条，植株健壮(图4)；0.6 mg/L NAA与IBA配合，诱导的根数减少。从根系的生长情况看，低浓度诱导的根系较为细长，生长素浓度达到0.4 mg/L后，生成的根粗且长。差异显著性分析表明，0.6 mg/L NAA、0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA、0.4 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA 3个处理间的差异不显著，但3者与其他生长素处理间则多存在显著性差异。综合考虑，MS+0.6 mg/L NAA+30 g/L蔗糖应是土田七的最佳诱根培养基，采用MS+0.4 mg/L NAA+0.1～0.2 mg/L IBA+30g/L蔗糖也有良好的效果。

表4 不同无机盐浓度对生根的影响

表5 不同生长素浓度对根系分化的的影响

3 结论与讨论

已有的姜科植物组织培养研究报道中也多采用茎尖或者茎段作为接种外植体直接诱导芽增殖途径进行繁殖[2-14]。本研究预试验中曾用土田七的根茎和叶片作为外植体，发现存在根茎易污染，叶片易褐化且难以诱导出愈伤组织的问题。采用土田七的茎尖作为外植体，由于该材料生长于地上，带菌量相对较少，且有叶鞘包裹，感染杂菌的概率低，加之茎尖外表较光滑，消毒效果好，材料污染率低。茎尖基部幼芽长出快，数量多，这可能与茎尖组织分生能力强，生长速度快有着一定的关系[15]，因此，茎尖是土田七组培快繁理想的外植体材料。

适宜的无机盐浓度是培养中的细胞所必需的，然而不同植物的芽苗对其无机盐浓度的要求不一致。姜科植物组织培养研究报道中多采用MS培养基进行芽的诱导和增殖，生根培养阶段不同的姜科种类对无机盐的要求有所不同。戚华沙等在姜黄的离体培养研究中发现，1/2MS、3/4MS、MS等3种无机盐浓度对芽增殖系数的影响差异不显著，但对芽苗的生长势有一定的影响，以MS为增殖和生根最佳浓度[14]。范燕萍等在红球姜的组织培养与快速繁殖中，MS为生根最佳无机盐浓度[4]。文慧婷等用1/2 MS诱导瓷玫瑰幼芽生根，发根早，且根多而粗壮[8]。熊友华等用种子胚研究圆瓣姜花的繁殖技术，认为低无机盐质量浓度的1/2 MS培养基比MS培养基更有利于其生根[16]。本研究中，全量的MS无机盐对土田七芽增殖效果最好，3/4MS～MS可以满足生根培养的要求。

植物生长调节剂的种类、水平以及相互组合的选择对组织的产生与分化十分重要。6-BA和NAA的组合有利于土田七外植体的芽诱导及芽的增殖，但最佳配比水平有所不同。土田七芽诱导培养试验中，在0.5 mg/L的NAA条件下，添加不同浓度的6-BA，芽的萌发率有一定的差别。当添加6-BA浓度为2.0～3.0 mg/L时，有利于新芽的分化，平均每个茎尖可长出近3个幼芽。芽的增殖培养中，3.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L NAA配合时，幼芽多，且粗壮，平均芽增殖系数达到4.32，该配比是幼芽增殖的最佳组合。

土田七组培苗生根比较容易，即使在无激素环境下也能够长出根，但效果较差，低浓度的生长素水平生根效果也较差。单独使用NAA，浓度为0.6 mg/L时，获得最佳生根效果，平均生根数9.74条，根粗壮、发达，植株长势好。NAA和IBA配合使用时也能达到良好的效果，适宜的浓度为NAA 0.4 mg/L，IBA 0.1～0.2 mg/L。

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