肺泡灌洗液蛋白组学在肺癌中的研究进展

杨正东 陈益民★ 刘永林 何一波

肺癌是全世界致死率最高的一种常见恶性肿瘤，每年约140万人死于此病［1］。尽管肺癌的治疗水平有较大进步，但大多数患者确诊时已处于癌症的后期，错过了最佳治疗时机，5年生存率仅10%～15%［2］。肺癌是一种多因素导致的疾病，目前我们对于肺癌的认识还显著不够，肺癌的发病机理﹑早期诊断及治疗监测等方面亟待提高。蛋白质组学能从整体的角度阐明与肺癌相关的蛋白成分的变化，从而帮助我们从分子水平了解肺癌的发生﹑发展过程，这在肺癌的早期诊断﹑预后监测及治疗方面发挥重要作用。支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）作为理想的临床标本在研究肺部疾病方面具有明显优势，肺癌患者的BALF蛋白组学研究在解决肺癌这一难题上具有更广阔前景。

1 BALF蛋白组学

1.1 BALF的介绍 2002年中华医学会呼吸学会制定的《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范草案》中关于BALF的临床操作步骤为：（1）首先在要灌洗的肺段经活检孔通过一细硅胶管注入2%利多卡因1～2ml做灌洗肺段局部麻醉。（2）然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入37℃灭菌生理盐水，每次25～50ml，总量 100～250ml，一般≤ 300ml。（3）立即用 50～100mmHg 负压吸引回收灌洗液，通常回收率为40%～60%。（4）将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液，并记录总量。（5）装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中（减少细胞粘附），置于含有冰块的保温瓶中，立即送往实验室检查。

现已知BALF成分非常复杂，包含多种细胞（气道上皮细胞﹑肺泡巨噬细胞﹑中性粒细胞﹑单核细胞等）和大量可溶性成分（脂类﹑核酸﹑蛋白和多肽）［3］。BALF中蛋白种类繁多，其中部分来源于上皮细胞和炎症细胞分泌产物，另一部分来源于循环血液。与血液相比，用BALF做蛋白组学分析优势在于其蛋白浓度低，高丰度非特异性蛋白种类少，显著增加了发现肺部疾病特异性蛋白的机会。

1.2 主要技术 目前主要应用于BALF蛋白组学分析技术包括二维凝胶电泳（2-DE）﹑液相色谱（LC）和质谱（MS）。在二维凝胶电泳中，蛋白质根据其等电点和分子量分别在第一维和第二维平面上分离，然后经过染色得到二维蛋白图谱。质谱法是将被测物质离子化，按质荷比分离，经放大器形成图谱从而分析物质成分，具有高通量﹑高灵敏度﹑检测速度快﹑重复性好等优点。随着质谱的快速发展，使其成为蛋白组学的核心技术。不同类型的质谱功能也有所不同，液相色谱联合质谱法对小分子量﹑疏水性蛋白的鉴定与定量具有明显优势，被认为是2-DE的重要替代方法。

2 BALF蛋白组学与肺部疾病

由于不同病理机制都可能导致BALF中某一蛋白含量的增高或降低，因此分析单一蛋白对特定疾病的价值不大。Bell等［4］于1979年首次用BALF做蛋白组学分析，建立了吸烟者与未吸烟者的BALF二维凝胶图谱。随后，许多学者［5-7］通过BALF蛋白组学研究了多种肺部疾病如：结节病﹑特发性肺纤维化﹑过敏性肺泡炎﹑慢性阻塞性肺疾病等。研究结果表明，不同肺部疾病会引起BALF中大量蛋白的差异表达，这些差异蛋白质又参与了不同生物途径，发挥不同生物效应。因此，鉴定这些蛋白质将有助于了解肺部疾病的病理机制，筛选生物标志物以及发现新的治疗靶标。

3 BALF蛋白组学与肺癌

目前，肺癌蛋白组学主要目的是寻找敏感性高﹑特异性好的生物标志物，从而帮助临床对肺癌进行早期诊断﹑预后监测以及开辟新的治疗方法。现已有很多关于肺癌蛋白组学的相关报道，但大部分研究标本集中在组织﹑血液和痰液等，这些标本或多或少存在自身缺陷。组织标本取材创伤较大﹑不易获取。另外，大多数肺癌患者早期发病隐匿，组织标本在早期诊断上具有困难。痰液标本取材简单﹑无创，但标本质量容易受咳痰方式影响。血液标本中蛋白成分复杂，大部分都是高丰度﹑非特异性蛋白，这对研究肺癌相关蛋白具有严重干扰。由于BALF具有微创﹑干扰蛋白少﹑与癌组织相邻等优点，使其能更好地应用于基础研究和临床实践。近些年来，越来越多的学者开始以BALF为样本研究肺癌蛋白组学，并取得了很多新的成果。

3.1 诊断性标志物 良好的诊断性标志物必须具有高敏感性和特异性，在疾病的早期即可出现明显的变化。目前，BALF蛋白组学研究发现了许多对肺癌具有诊断价值的标志物，其中上清可溶性蛋白有：丙酮酸激酶M2（PKM2）﹑AKR1B10［8］﹑天冬氨酸蛋白酶A（Napsin A）﹑中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）［9］﹑补体 C4-A（CO4A）﹑结合珠蛋白（HPT）﹑谷胱甘肽S-转移酶（GTSP1）［10-11］﹑TIMP-1﹑载脂蛋白2﹑胱抑素 C［12］等。

Pastor等［8］于2012年首次真正意义上做了有关肺癌患者BALF蛋白组学的临床研究。他们用2-DE和基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测出了与肺癌和COPD有关的40种蛋白，发现PKM2和AKR1B10在肺癌组中显著上调。PKM2是糖酵解的关键酶，能帮助肿瘤细胞在低糖﹑低氧环境中生存，促进肿瘤的侵袭［13］。AKR1B10能高效催化视黄酸的降解，视磺酸的缺乏与气道鳞状上皮化生和上皮间质转化有关，这可能是BALF中AKR1B10高表达导致肺癌的病理机制。Li等［9］提出BALF中糖蛋白最有望成为肺癌诊断标志物，他们用蛋白组学方法发现8种糖蛋白在肺癌组中显著升高，其中Napsin A以55ng/mg为临界值诊断肺腺癌的敏感性和特异性分别为84.21%﹑66.67%。最近，Hmmier等［12］用非标记质谱法和ELISA法研究发现TIMP-1﹑载脂蛋白2﹑胱抑素C在肺癌患者BALF和血清中均明显升高，可作为肺癌的诊断指标。TIMP是基质金属蛋白酶（MMP）天然抑制剂，MMP存在于正常大多数组织和体液中，在癌症中被认为与肿瘤的侵袭与转移有关。GTSP1是上述唯一在肺癌组中表达下调的蛋白，GTSP1是一种主要的解毒酶和应激反应信号蛋白，是细胞抵御致癌物质和化疗药物的重要组成部分。研究表明［14］，GTSP1能负性调节细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）活性，而CDK5过度活化与细胞异常增殖和癌症侵袭有关，这可能是其在肺癌中表达下调的原因。

Uribarri等［11］用二维凝胶电泳建立了139个肺癌患者和49个肺部良性病变患者的BALF差异蛋白图谱，经磁珠免疫法验证分析得出：联合检测载脂蛋白A1（APOA1）﹑CO4A﹑CRP﹑GSTP1和血清淀粉样p物质（SAMP）在诊断肺癌上的敏感性为95%，特异性为81%，SAMP是最好的肺癌诊断标志物，单独诊断肺癌的敏感性为95%，特异性为66%。此外，在肺癌患者BALF细胞碎片中也发现了许多与肺癌密切相关的蛋白，如：S100-A8﹑膜联蛋白A1﹑膜联蛋白A2﹑胸甘磷酸化酶（TYMP）和谷氨酰胺转移酶2（TG2）等［15］，表明不管是可溶性蛋白还是细胞分泌蛋白都可作为肺癌标志物进行研究。

3.2 分型标志物 肺癌可分为两大类：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞癌（NSCLC），临床上以NSCLC最为多见。NSCLC中大多数为腺癌，其次为鳞状细胞癌﹑大细胞癌及极少数变异型肺癌。不同类型的肺癌临床治疗﹑疗效反映及预后皆不相同。如最近批准了通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）﹑表皮生长因子受体（EGFR）﹑间变性淋巴瘤激酶（ALK）和活性氧物质（ROS-1）用来靶向治疗非鳞状细胞癌的NSCLC的几项方案，因此准确地对肺癌进行分型十分重要［16］。

Uribarri等［11］研究发现了NSCLC和SCLC患者BALF中几种差异蛋白：CRP﹑GSTP1﹑SAMP﹑STMN1。其中GSTP1和STMN1在SCLC中表达较高，联合检测两者鉴别NSCLC和SCLC的敏感度为90%，特异性为57%。STMN1是最重要的鉴别指标，单独鉴别NSCLC和SCLC的敏感性为90%，特异性为52%。STMN1是一种肿瘤蛋白，参与微管动力学，研究表明其在小细胞肺癌相关细胞的细胞膜中过表达，与肺癌分化不良有关，有可能作为抗癌治疗靶点［17］。Hmmier等［12］也发现了BALF中肺腺癌与肺鳞癌之间的许多差异蛋白，其中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）在鳞癌中的含量是腺癌的11.8倍，叶酸受体α在腺癌中的含量是鳞癌的14倍，这与用免疫组化技术分析肺癌组织的结果相同［18-19］，表明其可能作为肺癌分型的重要标志物。

4 展望

肺癌的高发病率和病死率一直是困扰我们的难题，蛋白质是生命活动的主要承担者，如果能找出肺癌特异相关的蛋白将为攻克肺癌这一难题带来希望。BALF以其独特的优势被越来越多的学者选作研究肺部相关疾病的样本，蛋白组学能检测出BALF中与肺癌相关的更敏感的生物指标，从而有助于肺癌的早期诊断﹑预后监测及分型。不过，目前肺癌BALF蛋白组学方面还有不少问题有待解决，比如样本的收集﹑处理以及检测方法还存在标准化的问题，这些都是影响检测结果的重要因素，其中最重要的是可重复性检测。只有先解决这些问题，BALF蛋白组学的研究成果才能真正应用于临床。另外，BALF中蛋白含量的动态范围约有1010，然而质谱只能检测出102～104种蛋白，对于低丰度﹑低分子量的蛋白检测依然存在难度。肺癌BALF蛋白组学的研究起步较晚，文献报道的样本量存在不足，研究方法较单一，检测出的相关蛋白分子还需要更多研究去验证。但是，目前研究显示肺癌BALF蛋白组学具有良好的前景［20］，随着蛋白组学相关技术和研究方法更加完善，期待将来能检测出更多的敏感性高﹑特异性好的肺癌生物标志物，使我们能从分子水平全面了解肺癌发病机理，从而能够对肺癌患者准确地做出早期诊断﹑分型﹑评估预后以及开辟新的有效治疗方法。

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