脂肪组织长期储存的研究进展

张佩祺 综述 周双白 李青峰 审校

【提要】 自吸脂术出现以来，使用脂肪组织进行软组织填充已成为临床常见的治疗方法。但目前临床仍存在一处填充需要多次移植的情况。如能一次抽吸后对脂肪进行妥善保存，并在需要时进行再次注射，就可以减少抽脂次数，减轻患者痛苦。因此，对脂肪组织进行长期储存并减少其重吸收率具有重要的临床意义。本文就脂肪组织长期储存的研究进展进行综述。

自体脂肪移植填充是目前临床常用的软组织填充方法。脂肪组织具有来源丰富、操作简单、无排异反应等优点，可用于瘢痕填充、创伤引起的面部萎缩[1]、Romberg病[2]、皱纹及乳房填充[3]等方面，是美容或修复领域的常用技术。

但脂肪移植存在重吸收问题，留存率仅30%～60%[4]。即使在细胞辅助移植等技术的帮助下，可提高脂肪留存效率，但目前大部分情况下仍需要多次进行脂肪移植，以达到精确的修复效果[5]。如能长期保存抽取的脂肪，可减少脂肪抽吸次数，减轻患者痛苦，并提高治疗效率。因此，脂肪的长期储存成为了脂肪移植治疗中的重要课题。本文将从冷冻温度、保存方式及冷冻保护剂使用等方面，对现有的脂肪组织保存方法的研究进展进行综述。

1 脂肪组织与细胞保存的不同及难点

目前，细胞冻存技术已经比较成熟，一般多为加入冻存保护剂后进行程序降温或玻璃化降温。在保存细胞时，由于细胞多为分散的单个细胞或几个细胞聚集的小团块，因而在添加冷冻保护剂后可以与保护剂充分混匀，达到较好的保护效果。且细胞保存仅涉及单一细胞的保存，在选择冻存方法及冻存保护剂时均只需考虑该细胞的特性，因而选择较固定且单一。

而保存脂肪组织的难度则大于保存细胞，主要因为①脂肪组织为颗粒或团块，在与冷冻保护剂混合时难以使保护剂完全渗透入组织团块内部，导致颗粒中心部分的细胞或组织难以得到充分保护，冻存后的细胞活性也会因此受到较大影响；②组织保存涉及多种细胞，目前的研究中，构成较复杂的组织的保存仍处于探索阶段[6]。脂肪组织含有脂肪细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞及血管组织，因而在保存液的选择及冻存方法上仍未形成共识。

2 脂肪长期储存的新进展

目前常用的脂肪组织冻存法为程序降温法，复苏则采用快速复温法。流程如下：①将脂肪组织进行低速离心，分离上层油脂及下层肿胀液；②将脂肪组织与冻存保护剂混合后分装入冷冻管中；③将冷冻管置于梯度冻存盒，以每分钟降温10℃的速率[7]进行降温，待降至-80℃后移至液氮中进行长期保存；④复苏时将冷冻组织取出后直接置于37℃水浴中进行快速复苏。

该方法主要参照细胞保存的方式，在保存脂肪组织时仍存在问题。快速冷冻法及等温玻璃化法也被应用于组织保存，但其效果仍未明确。

2.1 温度对脂肪保存的影响

细胞和组织长期体外保存最主要的手段为低温冷冻保存，冷冻保存生物样本对于细胞及细胞内酶的活性维持均有较好作用。保存温度从4℃至-196℃（液氮）之间均有使用。在脂肪组织保存上，对于温度的不同选择是否会影响脂肪细胞活性及移植后重吸收率仍无定论。

一般认为，冻存温度越低组织活性保留越好。但Shoshani等[8]将脂肪组织于-18℃中冻存2周后注射至裸鼠皮下，发现脂肪细胞活性与成活率接近新鲜脂肪组织。Moscatello等[9]将脂肪组织分别储存于-20℃及液氮中，液氮组的脂肪细胞活性及ADSC活性均高于-20℃组。Wolter等[10]发现，于-80℃中冻存的脂肪组织，其脂肪细胞活性高于在-20℃中冻存的脂肪组织，且移植后成活率更高；如有冷冻保护剂存在，则成活比例更高。Atik等[11]将脂肪组织分别冷冻于-35℃与液氮中6个月，前者明显出现脂肪细胞数量减少、脂肪空泡及纤维变性等问题，后者保存效果较好。

但是，与上述结果不同，MacRae等[12]将脂肪组织分别冷冻于-20℃及液氮中，未见两组细胞活性有明显差异。Li等[13]将脂肪组织加入羟乙基淀粉后，分别冻存于-20℃、-80℃和-196℃中，脂肪细胞活性均无明显差异。Erdim等[14]在4℃下存储脂肪细胞2周，其活性大于-20℃或-80℃冷冻条件下的脂肪细胞，虽相比新鲜脂肪组织活性略有下降，但无统计学差异。Lidagoster等[15]也得出与此相近的结论并指出，相较于1℃保存的脂肪组织，-16℃保存下的组织会有更明显的炎症反应和组织坏死，不利于脂肪移植后的存活。由于液氮保存大量脂肪组织的高成本限制了其临床应用，以上结果提供了可使用商业型冰箱储存脂肪组织的证据，降低成本的同时也增加了低温冷冻法长期保存脂肪组织在临床上应用的可行性。

值得注意的是，以上研究均存在一个共同的问题，组织保存和移植后观察时间均较短，温度对长期保存脂肪的活性和移植后效率的影响仍需进一步研究。

2.2 冻存方式对脂肪保存的影响

现阶段常用的冻存方式主要分为慢速冻存法（程序冻存法）和快速冻存法（玻璃化冻存法）。

慢速冻存法作为传统的冻存方法在细胞和组织储存上已经使用多年，技术较为成熟。常用的步骤为将脂肪组织进行预处理后（通常添加冷冻保存剂），在12 h内以较慢速度降至-80℃，再移至液氮中进行储存。慢速冻存法具有安全、降低组织损耗等特点，对复合组织的生物活性具有较好的保护作用[16]。Conti等[7]将新鲜脂肪组织以慢速冷冻法降温后置入液氮中冻存，2周后于小鼠皮下进行脂肪移植，移植1周后MRI显示脂肪吸收明显，但人脂肪间充质干细胞（ADSC）的再生与分化能力未受明显影响。Minonzio等[17]认为，慢速冷冻法冻存的ADSC分化能力和增殖能力无明显异常。由于慢速冷冻法会在降温过程中产生大量结晶，同时出现渗透压的改变。冰晶会对细胞产生一定的机械损伤，而渗透压会使细胞膜出现皱缩，影响细胞复温后的性能。

快速冻存法也被称为玻璃化冻存法，是将组织置于高浓度的冻存保护剂中，然后直接放入液氮中进行冻存[18]。脂肪组织的玻璃化冻存暂无明确的研究结果，但是其他组织，如胚胎[19]、精子[20]、卵母细胞[21]等，均有证据表明快速冻存法对组织和细胞活性的保存更好。玻璃化冻存虽然对组织活性的保存有效，且相比于慢速冻存法更节省时间和冻存空间，但高浓度的冻存保护剂带来的细胞毒性问题仍不能忽略。

除以上两种已较为常见的冻存方式外，近年来新兴的一种方法为等温玻璃化，即将样品置于高浓度的糖、多元醇及有机聚合物中，在室温下进行干燥处理。过程中不会结冰，但生化反应停止，样本可以免受低温损伤[22]。低温会引起酶活性降低，活性氧的清除随之减弱，导致脂肪发生过氧化反应，减少脂肪细胞的活性或引起脂肪组织的纤维化，影响脂肪移植效果[23-24]。这种新兴的、无需冷冻的方法还需要更多的研究来证实其对脂肪组织的保存效果。

2.3 冷冻保护剂对脂肪组织保存的作用

冷冻保护剂是在低温冻存过程中，保护细胞免受低温后水分子结晶的破坏而添加的溶剂，一般分为渗透性和非渗透性两种。前者多为小分子中性物质，弱化水结晶过程，减少对细胞结构和功能的破坏，包括甘油、DMSO、丙二醇等溶剂。非渗透性保护剂多为大分子，通过降低溶质浓度减少低温冷冻对细胞造成的损伤，包括氨基酸、聚乙二醇、白蛋白、羟乙基淀粉等。

肖斌等[24]发现，脂肪组织在不同的冻存条件下，需不同的冻存保护剂才能达到较好的细胞保护效果。-80℃冻存时，添加15%DMSO的细胞活性较高；-196℃冻存时，添加15%DMSO＋6%丙二醇的细胞活性较高。仇侃敏等[25]的研究表明，相同冻存条件下，胎牛血清（FBS）+8%DMSO相比于无血清冻存液更有利于保持脂肪细胞活性，并明显提高复温后的存活率及移植后成活率。另有研究显示，加入DMSO+海藻糖的脂肪组织冻存后，相对比于新鲜脂肪组织，成活脂肪细胞数量仅少量减少，而相比于未加入保护剂组，存活细胞数量明显提高，且组织收缩率明显减低；在动物实验中，3组均出现组织重吸收现象，但加入冻存保护剂组明显小于未加入组，且未加入保护剂的脂肪组织中出现大量纤维化组织，影响术后效果[26]。

但大多数保护剂均存在一定的细胞毒性，如15%的DMSO有利于保存脂肪组织活性及移植后成活率[27]，但具有细胞毒性作用，复温后需经多次洗脱，才可进行移植，增加了手术成本。

非活体实验中，在慢速冻存及快速复温的条件下，海藻糖可单独作为冻存保护剂应用于脂肪组织的低温保存，因海藻糖无细胞毒性，洗脱时可减少步骤及耗时[28]。

3 总结与展望

脂肪保存在多年来的研究中已经有了一定的进展，但仍有很多问题需要解决。目前的研究中，大多数实验都为离体的细胞学实验或动物实验，仍需更多临床研究来提供更确切的研究数据。已有的研究结果表明，脂肪组织的保存可选择较高的温度；冻存保护剂的选择上，无毒、无异种抗原、易洗脱是今后发展的方向；DMSO及FBS应被更安全的材料替代。