超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道2在小鼠糖尿病神经性病变疼痛中的驱动作用

研究背景

糖尿病可引起外周感觉神经特异性退化，通常与持续性疼痛密切相关。痛性PDN往往使1/4糖尿病病人受累，典型的特点是病人表现出一系列不愉快的症状，如自发痛、机械性痛敏（由轻触导致的疼痛）和感觉异常（麻刺感和闪痛），也有的表现为对热痛不敏感等阴性症状。尽管PDN发病率高，但对其病理生理的研究较少。解剖学上的变化（脱髓鞘和表皮内神经末梢缺失）和功能学改变（神经传导速度降低）都是PDN和其他“顶梢枯萎”(Die back)类神经病变的特征。对外周神经系统的病理学研究表明，周围神经损伤是PDN的唯一驱动因素，PDN相关的持续性疼痛可能是由于伤害性感觉神经纤维（痛觉敏感神经纤维）中动作电位的重复发放所诱发的，但导致外周伤害性感受器过度兴奋的分子机制尚不清楚。

近期研究表明，HCN是驱动伤害性感受器兴奋性的关键性决定因素，HCN的不寻常之处是在-60 mV～ -90 mV范围内发生超极化而激活，而其他几乎所有的电压激活离子通道都是发生去极化而激活。在感觉神经元中表达的HCN亚型有四种(HCN1～4)，一半以上的小（直径）伤害性感觉神经元表达HCN2；而在大（直径）感觉神经元中，快速HCN电流主要由HCN1介导；HCN3几乎表达在背根神经节(DRG)的所有神经元上，而在心脏中发挥关键起搏作用的HCN4在躯体感觉神经元中表达较少。胞内cAMP升高能够引发电压依赖激活的HCN2和HCN4向膜电压更正的方向剧烈转变，导致静息膜电压下二者的内向电流增加；而HCN1和HCN3对cAMP相对不敏感，在调节神经元兴奋性方面影响较小。在伤害性感觉神经元中，炎症介质如前列腺素E2(PGE2)和缓激肽等通过G蛋白偶联通路激活腺苷酸环化酶，导致细胞内cAMP升高，进而激活HCN2而增加动作电位的自发放。

HCN阻断剂的强效镇痛作用以及在小鼠伤害性感觉神经元中特异性敲除Hcn2基因实验都证明了，HCN2在炎性疼痛和直接机械损伤感觉神经诱发的神经病理性疼痛中发挥着关键性作用；用药理学方法抑制Ih电流能够预防化疗药物所致的神经性病变（这种神经病变也是以顶梢枯萎去神经支配模式为特征）中的疼痛，此外也有间接证据暗示可能存在目前尚未被识别的HCN家族成员参与了自发性糖尿病的神经病变。

在本文中，研究者们通过糖尿病神经病变小鼠模型中 cAMP介导的HCN2激活诱发伤害性纤维的反复兴奋，进而导致中枢敏化和持续疼痛；又在I型和II型糖尿病模型中，通过药理学和遗传学方法阻断HCN2激活而发挥着强效的镇痛作用，都进一步证明了HCN2在慢性痛过程中起着关键性作用。

研究结果

1.链脲菌素(STZ)诱发小鼠PDN

单次腹腔注射STZ就可诱发野生型(WT)小鼠发生糖尿病。这是由于STZ选择性作用于胰岛β细胞引起DNA烷基化和细胞凋亡，进而导致胰岛素的生成减少和血糖升高。在STZ处理后第7天，小鼠的血糖浓度与处理前相比显著增加，此后STZ鼠仍然维持高血糖状态，而溶剂对照鼠的血糖未发生显著变化，本实验剔除了小部分STZ注射后未出现高血糖的小鼠。行为学检测发现糖尿病鼠伴有渐进性机械痛敏：其机械痛阈在2周时明显低于基础值，可持续到8周，机械痛敏增敏了约44%；18周后仍存在机械痛敏；而载体对照鼠的机械痛阈一直在基础痛阈水平。对于热痛，糖尿病鼠在6～8 周时的缩足潜伏期明显延长，表明其热痛敏感性降低。以上机械痛敏和热痛不敏感与人PDN的临床症状相一致。有研究表明STZ激活瞬时受体电位锚蛋白1 (TRPA1)可能参与了STZ处理后10天的痛敏过程，所以本研究更关注晚期（8～18周）的痛敏表型。但不知什么原因，本实验只有70%～90%的糖尿病鼠存在痛敏。

2.阻断外周HCN可逆转机械痛敏

挑选给予STZ后8 周痛敏最明显的实验鼠，腹腔注射伊伐布雷定(IVA)，后者可以同时抑制四种亚型的HCN； IVA不能通过血脑屏障，所以只在外周发挥作用。结果显示，单次注射IVA (2.5 mg/kg)就可以增高糖尿病鼠的痛阈，而且IVA的剂量越高镇痛作用越明显。对于所有的剂量，都是在IVA注射60 min后镇痛作用最明显，在120 min后镇痛作用消除；在对照组，IVA对急性机械痛阈和热痛阈几乎没有影响，这也证实了之前的研究结果，即HCN并不参与生理状态下的急性疼痛过程。此外，IVA对STZ诱发的热痛不敏感没有影响，表明热痛不敏感与HCN无关。

由于以上单次注射IVA (ip.)尚未使痛阈恢复到正常水平，为了研究通过重复给药是否增强镇痛效果，实验鼠被间隔2 h连续两次注射IVA (5 mg/kg,ip.)，其痛阈增高幅度超过单次给药的痛阈增高幅度，第三次ip.后完全恢复到糖尿病前的痛阈水平。在每次注射生理盐水后对照鼠痛阈会有小幅度升高，可能是由于抓取和注射等操作造成了实验鼠应激而导致的，但IVA组的镇痛效果更显著，特别是在多次给药后。为了检测以上累积效应是否与临床的间隔给药方案密切相关，实验鼠每天两次连续四天注射IVA，然后分别在给药前和给药后3 h测定痛阈。结果显示，IVA组在2～4 天的机械痛阈与在注射STZ之前基础痛阈相比，没有明显差异，而且与对照鼠相比痛阈更是逐渐在增高的。在停止给IVA的4天后，机械痛阈就恢复到给药前的糖尿病水平，说明IVA的镇痛作用是可逆的。

由于IVA抑制HCN所有的亚型，考虑到HCN4对心脏起搏非常重要，研究者们使用脉搏血氧仪来检测IVA对心脏功能的影响。不出预料，IVA (5 mg/kg)导致对照鼠的基础心率降低，但对糖尿病鼠的影响更小一些，这与之前报导的IVA较少影响STZ所诱发糖尿病大鼠心脏功能的结果相一致。IVA可降低对照鼠和糖尿鼠的呼吸频率，但在注射30 min时对血氧饱和度和脉搏都没有明显影响。裸眼没有观察到IVA对小鼠警觉性或探索性行为有明显影响。

3.阻断外周HCN对II型糖尿病的PDN有效镇痛

II型糖尿病是临床上最常见的类型，而db/db小鼠可自发形成II型糖尿病。在18 周时，与杂合对照鼠(db/+)相比，所有db/db鼠都表现出肥胖、高血糖和机械痛敏症状，单次注射IVA(5 mg/kg,ip.)能够使痛阈恢复接近正常水平。

4.HCN可抑制糖尿病鼠脊髓的c-Fos表达

c-Fos是神经元活动导致快速表达的一个早期基因，其蛋白在背角外层神经元中表达，表明外周伤害性感觉的持续传入和糖尿病的持续疼痛。在注射IVA（5 mg/kg，ip.3次，每次间隔2 h），在第一次注射6 h后就显著抑制了c-Fos的表达。表明PDN可引发脊髓背角神经元激活，通过外周阻断HCN可抑制相关神经元的活动。

5.在伤害性感觉神经元中敲除HCN2可干预糖尿病痛敏

为了研究4个HCN亚型中哪个亚型参与了糖尿病痛敏，研究者们培育了条件性敲除鼠，即特异性在DRG的伤害性感神经元中(NaV1.8+)敲除HCN2 (HCN2-CKO)。 注 射 STZ后，HCN2-CKO鼠及其同窝对照鼠(fHCN2)在1 周内都发生了高血糖症， 8周仍存在血糖增高现象。行为学检测发现，糖尿病fHCN2鼠存在渐进性的机械痛敏，而HCN2-CKO鼠在注射STZ后2、4、6和8 周都没有机械痛敏；脊髓背角的c-Fos表达情况是，糖尿病fHCN2鼠的c-Fos+神经元数目增加，而糖尿病HCN2-CKO鼠的c-Fos+表达却显著减少。表明在NaV1.8+伤害性感受器中特异性敲除HCN2能够再现由HCN通道阻断剂在外周产生的镇痛效果，HCN2在伤害性感觉神经元中的表达对糖尿病性疼痛有着至关重要的作用。

6.糖尿病减少了神经纤维在足底皮肤的分布

表皮内的神经纤维密度常被用作糖尿病PDN的诊断标准之一。免疫组化结果显示，与非糖尿病WT对照相比，注射STZ后(8 w) WT糖尿病鼠的表皮内神经纤维(PGP9.5+)密度显著降低， fHCN2鼠和HCN2-CKO鼠的表皮内神经纤维密度也显著降低。表明STZ模型鼠存在周围神经病变，HCN2-CKO鼠的疼痛表型（即机械痛敏和热痛不敏感）不是因为神经纤维分布的改变所导致的。进一步研究发现，糖尿病使表皮内的降钙素基因相关肽(CGRP+)纤维从17.4 ± 0.8降至12.5 ± 0.6个/mm，而小鼠的大多数TRPV1+纤维与CGRP共表达，所以CGRP+纤维的减少与STZ鼠的热敏感性降低是一致的。

7.糖尿病不影响感觉神经元中HCN2的表达

用免疫组化法观察腰部DRG中HCN2的表达情况。发现对照组HCN2在所有DRG神经元中的表达比例约为 73.2 ± 4.5%，与泛神经元标记物Tubulin β3共定位，HCN2在不同大小的神经元内都有表达；在STZ (8 w)糖尿病鼠，HCN2+神经元为72.5 ± 7.0%，与对照组比较无显著差异；对照鼠和糖尿病鼠的HCN2+神经元在DRG中的分布（小、中和大直径神经元）也没有差异。即糖尿病对HCN2在DRG中的表达和在不同大小神经元中的分布都没有影响。

那HCN2在外周神经的表达是否有变化呢？坐骨神经的免疫组化结果显示，STZ注射8 周后，对照鼠和STZ鼠轴突内的HCN2表达没有明显差异；在对照鼠表皮的神经纤维上未检测到HCN2，可能是HCN2在细小神经末梢中表达量低的缘故。

同时发现HCN1和HCN4主要表达在中和大直径的神经元上，HCN3在小、中和大神经元中都有表达，在DRG神经元的总体表达量和在各种大中小细胞中的分布比例和表达量，在对照组和糖尿病组之间都没有明显差异。总之，免疫荧光结果显示，糖尿病并不能导致任何HCN亚型在蛋白质水平的上调。

8.糖尿病不影响体外分离的伤害性感觉神经元的电生理特性

对已分离的小DRG神经元（直径 ＜ 20 mm）的电生理实验发现，随着注入电流的增加，来自对照鼠和STZ鼠神经元的发射频率和平台水平都相似。加入腺苷酸环化酶激活剂Forskolin (50 mM)，使细胞内cAMP水平上升和HCN2激活曲线向更正的膜电压转变，对照鼠和STZ鼠的神经元在注入电流后发放频率增加。神经元放电的cAMP依赖性敏化也反映在从Phasic（稳定电流诱导出一个或几个尖峰）到Tonic电发放模式的变化中（在整个电流注射期间持续放电）。STZ鼠和非糖尿病鼠在给Forskolin之前的Phasic/tonic电发放神经元的比例相似，在cAMP增高时的Tonic fi ring两组间也无显著差异。在STZ鼠和对照鼠以及Forskolin存在或不存时观察到相似的最大电流幅度，最大电流密度也不受糖尿病或cAMP增加的影响。以上结果印证了免疫荧光的结果：HCN2在糖尿病神经病变中没有发生表达的上调。

关于cAMP对小DRG神经元中电压依赖性HCN通道激活的影响，Forskolin引起STZ鼠和对照鼠神经元中HCN半激活电压(V1/2)向去极化转变，两组之间的转变幅度并没有显著差异。在比较含有低浓度(5 mM)或高浓度(25 mM)葡萄糖的细胞外溶液对神经元的Ih电流影响时，显示葡萄糖浓度对对照组或STZ组神经元的活化曲线或电流密度都没有影响，表明糖尿病中葡萄糖浓度的改变不会影响HCN通道的功能。

9.PDN与感觉神经元中cAMP的增高有关

以上研究表明糖尿病对HCN2表达或已分离的伤害性感觉神经元的电生理学特性没有影响，合理的推测就是糖尿病PDN时对体内HCN2的功能存在显著影响的因素，在神经元分离后迅速消失了，最可能的是通过引起伤害性感觉神经元内cAMP浓度的升高，进而导致HCN2活性的增强。因此，无论是对照鼠还是糖尿病鼠，在研究糖尿病对DRG中cAMP含量的影响时发现，来自高机械痛敏STZ鼠DRG组织的cAMP含量比非糖尿病鼠的DRG增高了8倍以上；而没有机械痛敏的糖尿病鼠（STZ没有导致疼痛）的cAMP浓度与非糖尿病对照组无显著性差异。除了直接与HCN结合外，cAMP还可以激活cAMP依赖性蛋白激酶A (PKA)，进而引起参与疼痛过程的NaV1.8和TRPV1等离子通道磷酸化激活。腹腔注射PKA抑制剂H-89（5 mg/kg，是抑制PGE2诱发炎性痛的有效剂量）可减轻STZ后8 周的机械痛敏，但没有IVA的效果显著。

讨 论

PDN是一种典型的“顶梢枯萎”神经病变，其中无髓C和少髓Aδ伤害性纤维先受累改变，进而形成自发放电。本研究进一步支持了假说：小伤害性感觉神经纤维的自发放电，能传入脊髓背角外层，诱发C-FOS在相关神经元内表达，可作为伤害性感觉传入的功能指标。在糖尿病鼠，HCN2在维持小直径传入神经纤维的放电以及参与糖尿病疼痛，本文提供了以下证据：①泛HCNs通道阻断剂IVA可完全抑制I型和II型糖尿病疼痛， IVA不能通过血脑屏障，阻断的是外周神经内的HCNs；②CKO-HCN2(NaV1.8+)可抑制与糖尿病相关的疼痛；③ IVA阻断HCNs和条件性敲除表达在NaV1.8+神经纤维中的HCN2都能抑制脊髓背角中C-FOS的表达。

多达80%的糖尿病病人表现对热痛不敏感，这与由神经病变引起TRPV1+细的无髓神经纤维在皮肤中支配的减少一致的。本研究证实STZ糖尿病鼠表皮内的肽能神经纤维（包括TRPV1+纤维）的退行性变与增高的热痛阈之间存在负相关。PDN病人最难以承受的症状就是机械痛敏(Mechanical allodynia)，即由轻触感引起的疼痛，可能是由大直径有髓神经纤维介导的。那么表达HCN2的细无髓纤维的自发活动是如何增强有髓粗纤维介导的机械痛敏呢？一个可能的解释就是“中枢敏化”，就是小直径伤害性感觉纤维的激活通过中枢敏化造成了粗纤维介导的机械痛敏。中枢敏化是脊髓背角神经元的可塑性变化，外周传入的无伤害性的机械性刺激（轻轻触碰）到脊髓背角的二级神经元转变为疼痛的感觉信号。

糖尿病鼠的伤害性感觉纤维放电增加的一个合理的解释是感觉神经元中HCN2表达上调，但本研究发现糖尿病鼠的HCN2蛋白表达和最大电流密度都没有显著变化。但糖尿病鼠感觉神经元的胞内cAMP显著增高进而激活HCN2，增强自发性和诱发性电发放， 用Forskolin升高胞内cAMP，进而增加小神经元的放电频率也证明了这一点。增高的cAMP也激活PKA，进而磷酸化激活NaV1.8和TRPV1等离子通道而参与疼痛的调控。此外，HCN阻断剂和基因敲除HCN2都可以完全抑制痛敏，表明HCN2在糖尿病导致的痛敏中发挥着至关重要的作用。与PKA抑制剂H-89的作用相比，IVA对糖尿病性机械痛阈的影响更明显也证实了这一点。

与单次给药相比，IVA多次给药可以达到更好的镇痛效果，有文献报道可能是因为IVA长效代谢物，其类似于吗啡的代谢物—吗啡-6-葡萄糖醛酸，作用比吗啡强10倍以上。IVA的通过抑制HCN依赖性心脏起搏器细胞的放电，从而减慢心率并减少了心肌的耗氧量，在临床上已经用于心绞痛的治疗。尽管要考虑到抑制HCN4可产生窦性心动过缓，但IVA在临床实际应用中表现出良好的安全性，无显著的心动过缓、视力障碍或对葡萄糖代谢的不利影响等。外周条件性敲除HCN2基因可有效缓解疼痛，未见明显副作用。

由于在非病理状态下激活需要的电压更负，HCN2在正常的动作电位范围内是关闭的，也不产生内向电流，所以阻断HCN2对神经元的基础兴奋性没有影响，也不影响基础痛阈。但在PDN等病理性疼痛状态下，只有当炎症介质诱发细胞内高cAMP时，HCN2才被激活。所以说只在病理状态下发挥作用的HCN2是一个理想的镇痛靶点。

（Tsantoulas C,Laínez S,Wong S,et al.Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated 2 (HCN2) ion channels drive pain in mousemodels of diabetic neuropathy.Sci Transl Med,2017,9(409): eaam6072.doi: 10.1126/ scitranslmed.aam6072. 徐州医科大学，张奉明 王 兵 译 刘兴君 校）