柱前衍生-液相色谱-串联质谱法测定葡萄和樱桃中单氰胺残留

兰 丰, 刘传德

(山东省烟台市农业科学研究院农业部果品质量安全风险评估实验室(烟台), 山东 烟台 265500)

单氰胺(cyanamide)又名氨基氰,分子式为CH2N2,主要作破眠剂使用,促进果树提早萌芽、果实提前成熟上市。由于提前上市的水果市场竞争力强,近些年有关单氰胺用于设施栽培的樱桃、葡萄、蓝莓等果树的研究越来越多[1-3]。然而,单氰胺对人体有一定的毒性,能引起接触性皮炎、头痛和恶心、呕吐等胃肠道症状[4]。美国环境保护组织(EPA)[5]将单氰胺列为高毒Ⅰ类危险农药。2015年我国[6]启动了果蔬植物生长调节剂使用调查与产品安全性评估研究,项目涉及的9种常用植物生长调节剂中包含单氰胺。我国[7]目前只规定了葡萄中单氰胺的最大残留临时限量值为0.05 mg/kg,其他作物未做规定,也没有相关的标准检测方法。

单氰胺极易溶于水,使用常规有机溶剂难以提取,相对分子质量小,浓缩过程易挥发,无特征吸收峰,遇酸碱不稳定,其残留检测极具挑战性[8]。目前国内外关于单氰胺的残留检测方法较少,主要以柱前衍生间接测定为主。Rust[9]利用1,2- 萘醌- 4- 磺酸钾为衍生试剂,测定植物中单氰胺的残留。衍生前经过两步净化处理:首先以硅藻土为固相分散剂,经洗脱、浓缩后,再经C18SPE柱净化,衍生产物经液相色谱紫外检测器测定。Reddy等[10]利用CHEM ELUTM固相萃取柱萃取葡萄汁中的单氰胺,与1,2- 萘醌- 4- 磺酸衍生反应,液相色谱紫外检测器测定。衍生前需要用100 mL正己烷预淋洗固相萃取柱,再用200 mL乙酸乙酯洗脱,衍生后用90 mL二氯甲烷萃取,整个前处理需要将近400 mL溶剂。张春涛[11]利用酸性氧化铝为固相分散剂、丙酮作淋洗剂、丹磺酰氯(dansyl chloride, DNS)进行柱前衍生,测定葡萄和土壤中单氰胺的残留量,以酸性氧化铝添加石墨化炭黑作固相分散剂的净化方式存在基质效应,而且人工填充柱子需要注意基质的松紧对结果的影响。Cheng等[12]采用多壁碳纳米管净化植物样品提取液,利用DNS与单氰胺衍生后进行测定。每类植物样品需要根据含水量多少确定加入提取溶剂的体积和净化剂的量,比较繁琐。柱前衍生法对样品前处理要求十分严格,特别是衍生前净化除杂步骤对衍生能否成功及试验可重复性至关重要。在上述已报道的柱前衍生测定单氰胺方法中[9-12],有的前处理操作比较繁琐,检测效率不高,有的消耗试剂较多。本文着重考察了不同提取溶剂/体系对单氰胺的提取及衍生效果的影响,建立了单氰胺柱前衍生后直接进样的检测方法。DNS作为伯胺、仲胺、氨基酸、羟基化合物等衍生化使用最为广泛的试剂,相关研究较多[13,14],在单氰胺衍生化检测方面也有不少应用,比较成熟,本文主要借鉴了美国环境保护组织[15]公布的DNS衍生土壤中单氰胺的条件。在检测器方面,优先选择灵敏度高、基质干扰小的液相色谱- 串联质谱进行测定。所建立的DNS柱前衍生- 液相色谱- 串联质谱测定单氰胺的方法,前处理简便、有效,可用于批量检测葡萄和樱桃中单氰胺的残留。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC- MS 8040液相色谱- 串联质谱仪(日本岛津公司); SHA- B恒温振荡器、SK- 1快速混匀器(常州国华电器有限公司); RE- 52AA旋转蒸发器(带北京博医康HX- 1050型恒温循环器)(上海亚荣生化仪器厂); Milli- Q超纯水系统(德国默克集团)。

甲酸(色谱级)购于上海阿拉丁试剂有限公司;丙酮(色谱纯)和乙酸铵(优级纯)均购于天津市科密欧化学试剂有限公司;甲醇(质谱级)、DNS(纯度≥98% )和单氰胺标准品(纯度≥98% )均购于上海安谱实验科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 溶液的配制

2 g/L DNS衍生剂:称取0.1 g DNS,用丙酮溶解定容至50 mL。

单氰胺标准工作溶液:将单氰胺标准品用乙腈配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/kg的单氰胺标准工作溶液。

单氰胺基质匹配标准溶液:用经提取、浓缩、定容后获得的葡萄和樱桃空白基质溶液分别将单氰胺标准品配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/kg的单氰胺基质匹配标准溶液。

衍生缓冲液:4 mL 0.2 mol/L碳酸钠水溶液和46 mL 0.2 mol/L碳酸氢钠水溶液混合,用水定容至200 mL。

无水硫酸钠:550 ℃烘烤4 h,于干燥器中保存。

1.3 实验方法

1.3.1单氰胺标准品的衍生化

用移液枪分别移取200 μL系列单氰胺标准工作溶液,置于具塞试管中,分别加入0.5 mL衍生缓冲液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生剂,涡旋30 s后,置于50 ℃水浴中，并振荡反应1 h,冷却至室温,用甲醇定容至2 mL,复溶后过0.45 μm尼龙滤膜。

1.3.2空白样品的衍生化

取200 μL空白基质溶液,加入0.5 mL衍生缓冲液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生剂,按1.3.1节步骤进行衍生化。

1.3.3样品衍生化

称取4.0 g经破壁机匀浆后的待测样品,加入20 mL乙酸乙酯,超声10 min,加入25 g无水硫酸钠,持续涡旋1 min,经滤纸过滤并用10 mL乙酸乙酯冲洗2次,所有滤液收集到100 mL具塞量筒中,最后转移到50 mL鸡心瓶中,于30 ℃水浴减压蒸发浓缩近干,加丙酮定容至1 mL,得到待衍生液。取0.5 mL待衍生液,加入0.5 mL衍生缓冲液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生剂,于50 ℃水浴中振荡反应1 h,冷却至室温,用甲醇定容至2 mL,复溶后过0.45 μm尼龙滤膜。

1.3.4色谱和质谱条件

色谱柱:Shim- pack XR- ODS色谱柱(75 mm×2.0 mm, 1.6 μm);柱温:40 ℃;进样量:1 μL。流动相A: 0.05%(体积分数)甲酸+2 mmol/L醋酸铵,流动相B:甲醇;流速为0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～0.90 min, 10%B; 0.90～3.00 min, 10%B～50%B; 3.00～3.10 min, 50%B～70%B; 3.10～3.60 min, 70%B～95%B; 3.60～4.00 min, 95%B; 4.00～4.01 min, 95%B～10%B。目标化合物出峰时间为2.5 min左右。

质谱条件:ESI+电离模式;多反应监测(MRM)模式;DL(desolvation)管温度为250 ℃;加热模块温度为400 ℃;干燥气流速为15 L/min；碰撞气压力为230 kPa。m/z276.0/156.1为定量离子对,m/z276.0/171.1为定性离子对。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂

单氰胺在43 ℃与水互溶,在水中有极高的溶解度,因此首先选择水作提取剂。但试验发现以水作提取剂存在两方面不便:一方面,提取后不易浓缩,并且浓缩过程单氰胺先于水挥发,易损失;另一方面,水可以提取出大量含氨基、酚羟基等能与DNS反应的极性化合物,不易除去,影响后续衍生。因此尝试采用乙腈提取,经盐析后,取有机层衍生分析,单氰胺回收率低。其中大部分单氰胺可能仍在水层,加之有机层提取了很多与DNS反应的杂质,影响了衍生效果,从而影响回收率。

鉴于以乙腈和水作提取剂不利于后续的浓缩和衍生,不建议使用二者作提取溶剂。再者,植物源样品含有的水对提取、浓缩不利,需予以去除。因此,本试验选取沸点低、便于浓缩的丙酮、甲醇、乙酸乙酯和乙醚等对单氰胺有较高溶解度的溶剂作提取剂,并通过过量无水硫酸钠除水,经提取、浓缩与DNS衍生等步骤,考察单氰胺的回收率。结果表明,在丙酮、甲醇和乙醚3组试验中,单氰胺回收率不足30% ,仅有乙酸乙酯组单氰胺回收率满足农残检测要求,具体回收率数据见表1。原因可能是乙酸乙酯相比其他3种溶剂提取的不利衍生的杂质较少,而DNS又过量,因此乙酸乙酯更适于作单氰胺的提取溶剂。

表1 葡萄基质中采用不同提取剂时单氰胺的回收率Table1 RecoveriesofcyanamideingrapematrixwithdifferentextractionsolventsTreatmentExtrationsolventRecovery/%Moistureretentionwater-acetonitrile20Moistureremovingacetone27methanol10ethylacetate75ether- -:nocyanamidederivativesweredetected.

2.2 方法学考察

2.2.1基质效应(ME)评判

为评价是否存在基质效应,对比了单氰胺标准溶液曲线与基质匹配标准溶液曲线。以单氰胺质量浓度(X, mg/L)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标得到线性方程。基质效应用ME=B/A×100%计算,A和B分别为单氰胺标准溶液曲线和基质匹配标准溶液曲线的斜率。一般情况下,ME在85% ～115%之间表示不存在明显的基质效应,由此判断,本检测方法中单氰胺基质效应不明显(见表2)。

表 2 单氰胺标准溶液与基质匹配标准溶液的线性方程、线性范围、相关系数(r2)和基质效应

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.2.2回收率、精密度和定量限

按0.01、0.05和1.0 mg/kg 3个添加水平向葡萄和樱桃样品中添加单氰胺,每个添加水平重复5次,并作空白对照。按本方法对样品进行处理和测定,考察单氰胺的加标回收率,结果见表3。单氰胺在葡萄和樱桃中的平均回收率为75% ～81% ,相对标准偏差为6.5% ～9.8% 。可见该方法具有较高的回收率和较好的精密度,可以满足葡萄和樱桃中单氰胺残留量检测需要。根据添加回收试验确定葡萄和樱桃中单氰胺残留检测定量限均为0.01 mg/kg,相关谱图见图1。

表3 葡萄和樱桃中单氰胺在3个添加水平下的回收率和相对标准偏差(n=5)Table3 RecoveriesandRSDsofcyanamideatthreespikedlevelsinthegrapesandcherries(n=5) FruitSpikedlevel/(mg/kg)Recovery/%RSD/%Grape0.01769.70.05769.81.0808.9Cherry0.01756.70.05817.01.0776.5

图 1 空白样品和加标样品的色谱图Fig. 1 Chromatograms of the blank samples and the spiked samplesa. the blank sample; b. the sample spiked with 0.05 mg/kg cyanamide.

2.3 实际样品测定

按所建立的方法对2016年抽取的山东潍坊、烟台两地的葡萄和樱桃中单氰胺残留量进行测定。20个樱桃样品(设施栽培)中有4个样品检出单氰胺残留,残留量为0.005～0.018 mg/kg。20个葡萄样品未有单氰胺检出。

3 结论

本研究利用过量无水硫酸钠除水,乙酸乙酯提取,提取液经浓缩后无需净化可直接与DNS衍生反应,建立了液相色谱- 串联质谱测定葡萄和樱桃中单氰胺残留的方法。免除了前处理过程的繁琐操作,简便、快速,可以满足农药残留检测要求,可用于葡萄和樱桃中单氰胺残留批量检测。同时,该方法中乙酸乙酯表现出来的优势也为研究DNS柱前衍生的科研工作者提供了有益参考。

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