快速溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法分析海洋沉积物中16种多环芳烃

宋晓娟, 李海燕, 尹明明, 马玉琴

(连云港市环境监测中心站, 江苏 连云港 222001)

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类持久性有机污染物,具有较强的致癌性和致突变性,美国环境保护局(EPA)早在1979年就将16种PAHs列入优先控制污染物名单中[1-4]。随着沿海工农业的发展,海洋环境中PAHs的污染也越来越严重[5-8]。PAHs的辛醇- 水分配系数相对较高,在水中的溶解度较小,在海洋中的最终归宿主要是沉积物。沉积物基质复杂,干扰物质较多,一般难以直接测定。发展高效、快速的分析方法对于研究海洋环境中PAHs的分布、来源等具有重要意义。

沉积物中PAHs的测定包括前处理与仪器分析两个环节。前处理包括索氏提取、超声提取、超临界流体提取、微波提取、快速溶剂萃取(accelerated solvent extraction, ASE)等多种PAHs提取方式[9-13]。ASE由于提取速度快、溶剂消耗量少、自动化程度高等优势,近年来被广泛应用[10,12],因此本研究选择该方式对沉积物样品中的PAHs进行提取。

PAHs的分析方法主要包括液相色谱法[14,15]和气相色谱- 质谱法[16,17]。液相色谱法灵敏度较高,但抗干扰能力不足,样品比较复杂时,会出现假阳性现象。海洋沉积物是有机污染物的重要载体,样品基质较复杂,可引起背景基线高、杂质干扰强等问题;气相色谱- 质谱法同时依靠保留时间和碎片离子进行定性,结果更为可靠,但其灵敏度不如液相色谱法高,难以满足痕量PAHs的测定。为了弥补这两种方法的不足,本研究选择气相色谱- 串联质谱法(GC- MS/MS)分析海洋沉积物中的PAHs,通过两级质谱对母离子和子离子进行筛选,可以在很大程度上扣除背景干扰,提高灵敏度[18-22],适合沉积物这类复杂基质中痕量PAHs的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱- 三重四极杆质谱联用仪(7890B- 7000C,美国Agilent公司);快速溶剂萃取仪(E- 914,瑞士Buchi公司);全自动氮吹浓缩仪(TurboVap II,美国Caliper公司);真空冷冻干燥机(TFD,韩国Ilshin公司)。

正己烷、丙酮、二氯甲烷(色谱纯,美国Fisher Scientific公司);硅胶(Si)SPE小柱(1 g/6 mL,德国CNW公司);无水硫酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);硅藻土颗粒(30～40目)、石英砂颗粒(20～30目)(瑞士Buchi公司);实验用水(屈臣氏纯净水);土壤标准质控样品(编号SQCI- 016,美国NSI公司)。

1.2 样品采集和预处理

采用抓斗式采泥器采集表层沉积物样品,置于棕色玻璃瓶中,经-40 ℃冷冻干燥后,用研钵研磨,过1 mm金属网筛后混匀,于4 ℃以下冷藏、避光、密封保存。

准确称取20.00 g样品,均匀混入4.0 g硅藻土颗粒,置于专用的玻璃纤维滤筒中。萃取腔(80 mL)底部放置专用的玻璃纤维滤膜,然后铺一层石英砂颗粒,再放入玻璃纤维滤筒,同时加入5.00 μL替代物中间使用液(20.0 mg/L),最后加入一定量的石英砂颗粒,直至石英砂距腔体顶部0.5～1.0 cm,最后用玻璃纤维滤膜封口,放入ASE仪中进行萃取,接收瓶体积为250 mL。

1.3 萃取与净化

1.3.1萃取

萃取溶剂:正己烷- 丙酮(1∶1, v/v);载气(高纯氮气)压力:0.8 MPa;萃取温度:90 ℃;萃取池压力:10 MPa;预加热平衡时间:3 min;静态萃取时间:5 min;放气时间:2 min;循环次数:3次;总萃取时间:45 min。

1.3.2净化

将1.3.1节所得的萃取液通过装有无水硫酸钠的漏斗进行脱水,并用氮吹仪浓缩至1.0 mL。预先用5 mL正己烷活化Si SPE小柱,然后加入已除去水分并浓缩后的萃取液,用正己烷淋洗2次,每次用量1 mL,之后用5 mL二氯甲烷- 正己烷(2∶3, v/v)溶液进行洗脱,收集全部洗脱液,常温下用微弱氮气浓缩至0.5 mL左右,加入5.00 μL内标中间使用液(20.0 mg/L),最终用丙酮- 正己烷(1∶1, v/v)溶液定容至1.0 mL,供分析用。

1.4 GC- MS/MS条件

1.4.1色谱条件

色谱柱:HP- 5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度:250 ℃;载气:高纯氦气(99.999% );流速:1.0 mL/min;进样量:1.0 μL;不分流进样;程序升温:初始温度70 ℃,以7 ℃/min升至240 ℃,再以10 ℃/min升至300 ℃,保持10 min。

1.4.2质谱条件

离子源:电子轰击(EI)离子源;离子源温度:230 ℃;扫描方式:多级反应监测(MRM)模式;电离能量:70 eV;传输线温度:280 ℃;溶剂延迟:5 min;碰撞气(高纯氮气)流速:1.5 mL/min。PAHs、内标及替代物的质谱参数见表1。

表 1 16种PAHs、5种内标及1种替代物的质谱参数

1.5 定性与定量

分别用精密注射器抽取0.50、2.50、5.00、25.0及50.0 μL的PAHs及替代物中间使用液(20.0 mg/L),用丙酮- 正己烷(1∶1, v/v)溶液稀释至1.0 mL,配制成质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.50及1.00 mg/L的系列标准溶液。配制过程中,每个浓度系列均加入5.00 μL内标中间使用液(20.0 mg/L),保证内标浓度均为0.10 mg/L。将该系列标准溶液在1.4节条件下按质量浓度从低到高的顺序进样分析。通过保留时间和NIST谱库检索对目标物进行定性,采用内标法进行定量。

1.6 质控手段

(1)仪器维护:使用全氟三丁胺(PFTBA)对MS进行调谐,优化相关参数;更换GC隔垫、衬管等配件,并老化色谱柱,保证仪器性能良好。

(2)空白试验:每10个样品做1次空白试验,保证目标物的含量不超过方法的检出限。控制措施如下:彻底清洗萃取池、玻璃器皿;无水硫酸钠、石英砂、硅藻土等使用前于400 ℃烘4 h。

(3)校准曲线:目标物相对响应因子的相对标准偏差小于20% 。每日测定校准曲线中间浓度点,与实际值的相对偏差小于20% ,否则重新绘制校准曲线。

(4)平行样品:每10个样品分析1个平行样品,要求相对偏差小于30% 。

(5)基质加标试验:每10个样品分析1个加标基质样品,控制回收率范围为40% ～150% 。

(6)替代物的回收率:建立替代物回收控制图,计算平均回收率p及标准偏差s,控制替代物的回收率在p±3s之间。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1萃取温度的优化

温度升高可加快沉积物中目标物的挥发,提高目标物分子和溶剂分子的运动速率,在一定程度上促进目标物从沉积物向溶剂中转移,从而提高萃取效率。但温度过高,也会造成目标物从溶剂中再次脱离而降低效率。

将高温处理后的石英砂作为空白,分成3组进行萃取温度的优化试验，3组石英砂分别加入5.00 μL PAHs中间使用液(20.0 mg/L),萃取温度分别设为70、90和110 ℃,其余条件同1.3.1节,考察了不同温度对PAHs回收率的影响,结果见图1。总体而言,低环数PAHs(如二环NAP、三环ACY)因沸点较低,其回收率也略低于高环数PAHs(如四环BaA、CHR,五环BbF、BkF及BaP),但其对温度的响应基本一致。当萃取温度由70 ℃升至90 ℃时,PAHs的回收率由85.4% 升至88.5%，根据t检验计算公式,t=1.516

图 1 萃取温度对16种PAHs回收率的影响(n=3)Fig. 1 Effects of extraction temperature on the recoveries of the 16 PAHs (n=3)

图 2 静态萃取时间对16种PAHs回收率的影响(n=3)Fig. 2 Effects of static extraction time on the recoveries of the 16 PAHs (n=3)

2.1.2静态萃取时间的优化

ASE包括3个过程:预热、静态萃取和释放萃取液,其中静态萃取时间是指在设定的高温、高压下,液态溶剂对沉积物样品的提取时间。萃取开始时,溶剂为空白溶剂,目标物在沉积物中的浓度相对较高,因此目标物会逐渐向溶剂迁移。随着时间的延长,目标物的迁移会逐渐减缓至停止,甚至还会从溶剂中再次脱离,因此存在一个最佳的静态萃取时间,保证萃取效率达到最高。

本研究将高温处理后的石英砂作为空白,分成3组进行萃取时间的优化试验,3组石英砂分别加入5.00 μL PAHs中间使用液(20.0 mg/L),静态萃取时间分别设为3、5和8 min,其余条件同1.3.1节,考察不同静态萃取时间对PAHs回收率的影响,结果见图2。16种PAHs在3个时间下的平均回收率分别为87.3% 、88.5%和85.8% ,当静态萃取时间由3 min增加至5 min时,根据t检验计算公式,t=0.628

2.1.3循环次数的优化

一般而言，循环次数越多，目标物的回收率越高，但次数过多，会浪费大量时间与成本，对回收率也没有显著改善。因此，综合考虑目标物回收率、操作时间与成本等因素，必须选择一个最佳的循环次数。

本研究将高温处理后的石英砂作为空白,分成3组进行循环次数的优化试验，3组石英砂分别加入5.00 μL PAHs中间使用液(20.0 mg/L),循环次数分别设为1、3和5次,其余条件同1.3.1节,考察不同循环次数对PAHs回收率的影响,结果见图3。循环次数从1次增加至3次时,16种PAHs的平均回收率由83.7%上升至88.5% ,说明仅设置1次循环并不能满足要求,可能会损失部分回收率;当循环次数由3次增加至5次时,各物质的回收率并无显著改善。因此将本研究的最佳循环次数设为3次。

图 3 循环次数对16种PAHs回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effects of cycle time on the recoveries of the 16 PAHs (n=3)

图 4 MRM模式下16种PAHs、5种内标及1种替代物混合标准溶液(0.10 mg/L)的色谱图Fig. 4 Chromatogram of the 16 PAHs, the five internal standards and the substitute in a mixed standard solution (0.10 mg/L) under multiple reaction monitoring (MRM) mode 1. decafluorobiphenyl; 2. NAP; 3. NAP- d8; 4. ACE- d10; 5. ACE; 6. ACY; 7. FLU; 8. PHE- d10; 9. PHE; 10. ANT; 11. FLT; 12. PYR; 13. BaA; 14. CHR- d12; 15. CHR; 16. BbF; 17. BkF; 18. BaP; 19. PER- d12; 20. IcdP; 21. DahA; 22. BghiP.

2.2 质谱条件的优化

首先设置质谱分析模式为单质谱扫描,扫描范围为m/z50～350,分别确定16种PAHs、5种内标和1种替代物的保留时间及各自的母离子。然后保持程序升温条件不变,设置质谱分析模式为产物离子扫描,逐步优化每种物质的子离子和碰撞能量,找出响应相对较高的两个子离子,分别设为定量离子和辅助定性离子。最后在MRM模式下,对0.10 mg/L的混合标准溶液进样分析,得到色谱图(见图4)。通过两级质谱对母离子和碎片离子进行筛选,所获得的色谱图背景干净,没有杂峰,且22种物质峰形尖锐对称,分离度较好,可以满足定性与定量要求。根据目标物与内标化合物的出峰顺序,分别确定了16种PAHs定量分析时所对应的内标物(见表1)。

2.3 方法学验证

试验过程严格按照1.6节的质控方案进行操作,采用石英砂做空白,经萃取、净化后,16种PAHs均未检出,说明各操作环节并未引入目标物。在优化后的质谱条件下对1.5节配制的系列标准溶液进样分析,以PAHs的质量浓度为横坐标(X, mg/L)、PAHs与相应内标的峰面积之比为纵坐标(Y)绘制标准曲线,回归方程和相关系数(R)见表2。由表2可知,16种PAHs的线性关系良好,R均大于0.997。对标准曲线的每个点重复测量5次,相对标准偏差为10.3% ～16.4% ,符合质控要求。后续分析时,为验证标准曲线是否有效,对每日新配的0.10 mg/L混合标准溶液进样分析,计算测定值与实际值(0.10 mg/L)的相对偏差为8.2% ～18.4% ,说明该标准曲线定量的准确度较好。

表 2 16种PAHs的回归方程、线性范围、相关系数和方法检出限

Y: peak areas ratio of the 16 PAHs to internal standards; X: mass concentration, mg/L.

在期望的方法检出限(MDL)范围内选择一个合适的质量浓度(本研究选择0.005 mg/L),平行测定7次,计算7次测定结果的标准偏差(s′),则MDL=s′×t(6, 0.99)。其中,99%的置信区间内,自由度为6时,t(6, 0.99)=3.143。当取样量为20 g时,根据该方法对16种PAHs的MDL进行计算,结果见表2。16种PAHs的MDL为0.048～0.234 μg/kg,能够满足痕量PAHs的测定要求。

为评价方法的稳定性,本研究选择近岸海域沉积物样品进行分析(n=6), 16种PAHs均有检出,含量范围为2.70～33.7 μg/kg (见表3)。将每个实际样品分成7份,分别进行萃取、净化和浓缩,然后日内重复进样,计算方法的日内精密度。同理,将每个实际样品分成7份,每日分别处理并进样分析,连续分析7日,计算方法的日间精密度(见表3)。同时,在每个实际样品中加入5.00 μL 16种PAHs的中间使用液(20.0 mg/L),按照上述方法进行萃取、净化、浓缩及定量检测,分析目标化合物的回收率,结果见表3。

由表3可知,目标物的回收率为75.8% ～97.8% ,符合1.6节中(5)的质控要求,说明样品的前处理过程并未造成待测物质的明显损失,能够保证定量的准确性。此外,日内与日间精密度均小于10% ,说明方法稳定可靠,能够保证日后的推广应用。

图 5 MRM模式下实际沉积物样品的色谱图Fig. 5 Chromatogram of a real sediment sample under MRM mode 1. NAP- d8; 2. FLU; 3. PHE- d10; 4. PHE; 5. FLT; 6. PYR; 7. BaA; 8. CHR- d12; 9. PER- d12.

2.4 实际样品分析

为验证该方法分析实际样品的可行性,采集连云港市近岸海域的表层沉积物(n=6),按照上述步骤进行处理,并同时分析土壤标准质控样品,以保证定量结果的可靠性。虽然海洋沉积物复杂的基质给PAHs的测定带来了困难，但利用串联质谱对目标物的离子碎片进行两次筛选，则可获得背景干净、基线平稳的色谱图(某一实际样品的色谱图见图5)。该方法对这种存在于复杂基质中的痕量PAHs具有很强的检测能力，有利于及时发现、控制PAHs的污染。此外,标准质控样品的分析结果如表3所示,16种PAHs的测定结果均在该质控样品的真实含量范围内,说明该方法完全可以满足实际样品的定性与定量检测。

表 3 16种PAHs在实际样品中的回收率、相对标准偏差、含量及其在质控样品中的含量(n=6)

Contents of the QC sample were determined after diluting 20 times with hexane- acetone (1∶1, v/v). -: no data.

3 结论

本研究采用ASE对海洋沉积物中的PAHs进行提取,并对萃取过程中的相关参数进行了优化。萃取液经净化、浓缩后,采用GC- MS/MS对16种PAHs进行定性与定量分析,通过两级质谱的筛选,能够在很大程度上扣除背景干扰,大大提高灵敏度。该方法样品前处理自动化程度高,操作简便,方法检出限低,且方法的回收率、稳定性均能满足质控要求,非常适合分析海洋沉积物这类复杂基质中的痕量PAHs。

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