p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在溃疡性结肠炎2种中医证型患者中的表达特点

2018-01-11汪芸，张玲，曾艳

现代中西医结合杂志 2018年1期

关键词：内蕴隐窝大肠癌

汪芸，张玲，曾艳

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

论著

p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在溃疡性结肠炎2种中医证型患者中的表达特点

汪芸，张玲，曾艳

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

目的探讨脾胃气虚证和湿热内蕴证溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜活检组织中p53、KRAS、APC蛋白及增殖指数Ki-67的表达特点和意义。方法根据中医辨证分型及有无异型增生将64例UC患者分为脾胃气虚证组23例，湿热内蕴证组22例，脾胃气虚证伴低级别异型增生组9例，湿热内蕴证伴低级别异型增生组10例。选取同期肠镜活检组织呈轻度慢性炎者10例作为正常组，大肠癌患者11例作为大肠癌组。采用免疫组织化学方法检测各组患者肠黏膜组织内p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67表达情况。结果UC各组患者肠黏膜组织内p53蛋白表达阳性和Ki-67位于隐窝上1/2者的比例均明显低于大肠癌组(P均<0.05)；脾胃气虚证组和湿热内蕴证组p53蛋白表达阳性和Ki-67位于隐窝上1/2者的比例基本相同；脾胃气虚证伴低级别异型增生组p53蛋白表达阳性和Ki-67位于隐窝上1/2者的比例高于湿热内蕴证伴低级别异型增生组，但差异无统计学意义；UC各组患者肠黏膜组织内均未见KRAS蛋白和APC蛋白表达。结论脾胃气虚证伴低级别异型增生患者存在更高比例的肠黏膜上皮p53蛋白过表达及黏膜上皮增生活跃、缺乏成熟现象等癌变危险因素，对于脾胃气虚证伴低级别异型增生患者应加强随访和肠镜监测。

溃疡性结肠炎；异型增生；p53蛋白；KRAS蛋白；APC蛋白；Ki-67

溃疡性结肠炎(UC)是一种结直肠的慢性非特异性炎症性疾病，病因尚不明确，复发率高[1]。病变范围广泛、病程长的UC患者发生UC相关性大肠癌(CAC)的风险增加，CAC也是UC最严重的并发症之一，且预后不良[2]。因此，全面评估UC患者癌变风险，加强对高危患者的随访和监测是提高CAC早期诊断率，改善患者生活质量和预后的重要策略。CAC的发生经历了炎症—异型增生—癌的过程，对于首次随访的患者，明确肠黏膜有无异型增生及其类型和程度对进一步确定治疗和随访方案具有指导作用，但是单纯从形态学的改变对异型增生与慢性炎症刺激引起的黏膜再生进行鉴别有一定困难，主要依靠观察者的主观判断，缺乏客观依据，因此常规病理观察的同时检测CAC相关标志物就显得非常必要[3]。中医辨证论治的临床思维方法在UC治疗中取得了很好的疗效，积累了很多有益的临床经验。本研究从UC 2种常见中医证型脾胃气虚证和湿热内蕴证入手，分析了1998年1月—2012年6月在我院住院且辨证为脾胃气虚证和湿热内蕴证UC患者的肠黏膜活检组织中癌变相关蛋白p53、KRAS、APC及增殖指数Ki-67的表达特点，旨在为研究中医证型与UC癌变关系，临床中应用生物标志物对UC患者进行随访监测提供一定的依据。

1 临床资料

1.1一般资料依据中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组2007年制定的《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[4]中的诊断标准，选取上述时期我院收治的UC患者64例，脾胃气虚证和湿热内蕴证诊断参照文献[5]有关标准。患者均经过电子肠镜检查并取肠黏膜活检。调取患者既往肠镜活检组织HE切片，由2位临床病理主治医师分别在光镜下观察，按照Riddell标准分类方法[6]确定有无异型增生并评价其程度，将患者进一步分为脾胃气虚证组23例，湿热内蕴证组22例，脾胃气虚证伴低级别异型增生组9例，湿热内蕴证伴低级别异型增生组10例。选取同期肠镜活检组织呈轻度慢性炎者10例作为正常组，大肠癌患者11例作为大肠癌组。

1.2免疫组织化学检测方法调取各组患者结肠镜黏膜活检石蜡包埋组织块，切片常规脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，EDTA(pH9.0)热修复，5% BSA封闭液封闭没有被抗原占据的空白点，滴加一抗标记，稀释比例分别是：p53 1∶400，KRAS 1∶20，APC 1∶50，Ki-67 1∶100，4 ℃孵育过夜，滴加二抗标记，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光镜观察。免疫组化结果的评判标准：>5%的肠黏膜上皮细胞核呈中等或强棕黄色为p53蛋白表达阳性[7]；KRAS蛋白阳性信号定位于细胞膜，细胞膜呈中等或强棕黄色为KRAS蛋白表达阳性；APC蛋白阳性信号定位于细胞质，细胞质内呈中等或强棕黄色为APC蛋白表达阳性；Ki-67阳性信号标记细胞核，细胞核呈中等或强棕黄色为Ki-67表达阳性，根据Ki-67阳性信号的主要分布位置分别记为隐窝下1/2(隐窝基底部，干细胞所在区域)和隐窝上1/2(黏膜表面上皮，提示癌组织增生活跃，上皮细胞缺乏成熟现象)。

1.3统计学方法数据应用SAS 6.0统计软件进行统计处理，采用2检验和Fisher确切概率法进行组间各指标阳性表达率比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组患者肠黏膜组织p53蛋白表达情况正常组未见p53蛋白表达，大肠癌组、脾胃气虚证组、湿热内蕴证组、脾胃气虚证伴低级别异型增生组、湿热内蕴证伴低级别异型增生组p53蛋白阳性表达率分别为63.6%(7/11)，4.3%(1/23)，4.5%(1/22)，44.4%(4/9)，20.0%(2/10)，脾胃气虚证组和湿热内蕴证组阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)；脾胃气虚证伴低级别异型增生组阳性表达率有高于湿热内蕴证伴低级别异型增生组的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。脾胃气虚证组、脾胃气虚证伴低级别异型增生组和大肠癌组免疫组化显色表现见图1～3。

2.2各组患者肠黏膜组织KRAS蛋白表达情况大肠癌组KRAS蛋白阳性表达率为36.4%(4/11)，其余组均未见KRAS蛋白表达。脾胃气虚证组和大肠癌组肠黏膜组织KRAS蛋白表达染色表现见图4及图5。

2.3各组患者肠黏膜组织APC蛋白表达情况大肠癌组APC蛋白表达阳性率为36.4%(4/11)，其余组均未见APC蛋白表达。脾胃气虚证组和大肠癌组肠黏膜组织APC蛋白表达显色表现见图6及图7。

图1 脾胃气虚证组肠黏膜组织p53蛋白表达显色表现(×200)

图2 脾胃气虚证伴低级别异型增生组肠黏膜组织p53蛋白表达显色表现(×200)

图3 大肠癌组(中分化腺癌)肠黏膜组织p53蛋白表达显色表现(×200)

图4 脾胃气虚证肠黏膜组织KRAS蛋白表达显色表现(×200)

2.4各组患者肠黏膜组织Ki-67阳性信号分布情况正常组、脾胃气虚证组、湿热内蕴证组Ki-67阳性信号均分布于隐窝下1/2；大肠癌组Ki-67阳性信号位于隐窝上1/2。脾胃气虚证伴低级别异型增生组和湿热内蕴证伴低级别异型增生组Ki-67阳性信号位于隐窝上1/2者(表现为接近表面上皮的细胞核呈连续弥漫分布的阳性)分别有2例(22.2%)和1例(10.0%)，但2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图8及图9。

图5 大肠癌组(中分化腺癌)肠黏膜组织KRAS蛋白表达显色表现(×200)

图6 脾胃气虚证组肠黏膜组织APC蛋白表达显色表现(×200)

图7 大肠癌组(中分化腺癌)肠黏膜组织APC蛋白表达显色表现(×200)

3 讨论

目前研究显示，具有低级别异型增生或不能确定的异型增生并在此后进展为高级别异型增生和/或CAC的UC患者，其p53蛋白表达阳性率明显高于同期随访中没有进展的患者；此外没有发生异型增生的UC患者肠黏膜中也存在p53蛋白过表达，而且这些患者在随访中出现了低级别异型增生或不能确定的异型增生，甚至有些进展为高级别异型增生[7]。这些现象提示p53蛋白可以作为预测CAC相关异型增生是否发生和进展的生物标志物。本研究结果显示，脾胃气虚证伴低级别异型增生组患者肠黏膜上皮内p53蛋白阳性表达率有高于湿热内蕴证伴低级别异型增生组的趋势，虽然差异无统计学意义，但也提示出现低级别异型增生的脾胃气虚证患者今后发生高级别异型增生和/或CAC的机会可能较湿热内蕴证患者更高，脾胃气虚证患者较湿热内蕴证患者可能具有进展和/或癌变的更高风险，对那些肠黏膜上皮具有低级别异型增生且同时伴有p53蛋白过表达的患者应加强随访。另外，本研究发现脾胃气虚证组和湿热内蕴证组各有1例p53蛋白表达阳性，患者目前虽然还没有出现异型增生，但也应注意肠镜动态监测。

图8 脾胃气虚证伴低级别异型增生组肠黏膜组织Ki-67阳性显色表现(×200)

图9 大肠癌组(中分化腺癌)肠黏膜组织Ki-67阳性显色表现(×200)

CAC病变过程中癌基因KRAS的激活发生在低级别异型增生向高级别异型增生发展的过程中[8]。另外CAC与散发性大肠癌发展过程中，各种分子事件的发生频率和顺序并不相同，由杂合性缺失或基因突变引起的APC基因灭活发生在UC癌变过程的晚期阶段，而且出现频率较低[9]。本研究结果显示，除大肠癌组外，其余组患者肠黏膜活检组织内均未见KRAS蛋白和APC蛋白表达，这与研究对象所处疾病阶段有关。今后的研究中笔者将收集UC伴高级别异型增生的病例并对现有UC和UC伴低级别异型增生的患者进行随访，动态观察KRAS蛋白和APC蛋白的表达情况，以此评估患者的病情和预后。正常大肠黏膜从基底至开口处可以分为增殖区、移行区和功能区，其中增殖区位于隐窝中下部，此处的干细胞不断产生新细胞，并向黏膜表面移行、分化和成熟。Ki-67是一种核蛋白，是反映细胞增殖情况的标记物。相关研究发现，随着UC患者肠黏膜异型增生程度的加重，Ki-67阳性分布位置也逐步向隐窝上部和表面移动，低级别异型增生患者肠黏膜上皮Ki-67阳性分布于隐窝的中上部分，而高级别异型增生患者分布于隐窝上部和表面上皮[10]。本研究中脾胃气虚证伴低级别异型增生组和湿热内蕴证伴低级别异型增生组共3例Ki-67阳性信号位于隐窝上1/2，且这3例p53蛋白表达阳性，提示联合p53和Ki-67免疫组化检测对判断UC患者肠黏膜活检组织内有无异型增生及程度具有临床参考价值。

笔者之前的研究表明，从病程、病变范围、炎症程度及异型增生的角度分析，脾胃气虚证UC具有癌变危险因素的患者比例明显高于湿热内蕴证，推测脾胃气虚证UC患者的癌变风险较湿热内蕴证UC患者更高[11]。本研究结果显示，不伴低级别异型增生的2种证型之间p53、KRAS、APC及Ki-67的阳性表达率基本相同；而脾胃气虚证伴低级别异型增生组p53蛋白表达阳性率和Ki-67表达阳性率均有高于湿热内蕴证伴低级别异型增生组的趋势，没有统计学差异的原因可能由于本项目是基于中医证型的临床基础研究，病例资料来源于中医院住院患者，限定条件较多，造成伴有低级别异型增生的病例数量较少。今后笔者还要收集更多的相关病例，特别是伴有低级别异型增生和高级别异型增生的UC患者，深入进行UC脾胃气虚证与以上CAC癌变标志物的相关性研究。

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Immunohistochemicalfeaturesofp53,KRAS,APCandKi-67inulcerativecolitispatientswithtwodifferenttypesofChinesetraditionalmedicalsyndromes

WANG Yun, ZHANG Ling, ZENG Yan

(Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)

ObjectiveIt is to explore the immunohistochemical features and its significance of p53, KRAS, APC and Ki-67 in the ulcerative colitis (UC) patients with two different types of Chinese traditional medical syndromes.Methods64 inpatients with UC were divided into four groups according to Chinese medical syndrome differentiation and classification with or without dysplasia: 23 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency (group A), 22 cases of syndrome of dampness-heat accumulation (group B), 9 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia (group C), 10 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia (group D). 10 cases with mild chronic inflammation in intestinal tissue were selected as normal group, 11 cases with colorectal cancer as colorectal cancer group. The expression of p53, KRAS, APC and Ki-67 was detected in every group by immunohistochemistry methods.ResultsThe proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in the patients in UC groups were significantly lower than that in colorectal cancer group (P<0.05). The proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in group A was the same as those in group B. The proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in the patients in group C was higher than those in group D, but the difference was not significant. A negative KRAS and APC staining pattern were detected in all patients in UC groups.ConclusionThe UC patients with syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia have a higher proportion of intestinal epithelial p53 over expression and high risk factors of cancer such as epithelial hyperplasia and lack of maturation, these patients should be given regular follow-up and colonoscopy screening.

ulcerative colitis； dysplasia； p53； Kras； APC； Ki-67