羊乳及其制品中掺入牛乳成分的双重PCR检测

宋宏新， 刘建兰， 徐秦峰

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

国际药典委员会的食品化学法典(CAC)调查报告报道，1980年至2010年，由经济利益驱使的25个最容易掺假的食品成分中，其中乳成分掺假在学术领域排名第二，在媒体报道排名第七，可见乳类掺假检测的重要性[1].羊乳因其独特的风味和营养价值而被多数消费者青睐，由于羊乳的泌乳期受季节性的波动影响较大，使得产奶量不如牛乳，且价格高于牛乳，故掺假现象时有发生，以此来获取利益[2,3].

由于常见乳品成分及形态的相似性大，有关乳物种鉴定一直是一个亟待解决的问题.常见的乳物种鉴定的检测技术有基于乳中高含量的蛋白质的方法，如免疫学[2]和电泳的检测技术，免疫学灵敏度较高但易发生假阳性且抗体保存性不足.电泳分为聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)[4]、毛细管电泳(CE)[5]和双向电泳[6]，在欧盟电泳是一种广泛的有效的牛乳检测手段，但是，基于蛋白质的方法不适于复杂母体来源的食品，因为很容易受热处理材料的影响而使得灵敏度降低[7].利用乳的一些特性，如外表、风味、质构的感官分析法近年来也悄然兴起[8]，但易随加工变化而挥发，加工损失较严重；常用的液相(HPLC)[9]、气相(GC)[10]色谱检测方法和红外(IR)[11]、近红外(NIR)[12]及核磁共振技术(NMR)[13]等光谱检测方法，其中液相和气相费时费力、需要复杂的样品前处理，光谱技术几乎无需对样品预处理且其适合在线过程控制，但光谱需要建立复杂的模型，掌握和普及程度不足且仪器昂贵.

基于DNA的PCR技术，因其在高温高压下可以稳定存在的特点[14]而在食品掺假领域悄然兴起，并已经广泛应用于食品掺假的验证和证明[15].在乳制品中DNA之所以可以作为掺假的检测目标是由于DNA在高温、高压和化学处理的条件下依然稳定存在[16].据报道，反刍动物的乳可以用作DNA的来源，因为它具有大量的体细胞，主要是白细胞，而且还含有来自挤奶母牛的上皮细胞，且在所有独立细胞间的结构高度保守[17]，含有适用于PCR扩增的基因组DNA[18].

本实验则基于分子生物学技术的发展，建立了提取牛羊乳及其制品中的DNA检测方法，通过聚合酶链式反应对DNA片段进行扩增，再以琼脂糖凝胶电泳来对结果进行检测，具有快速、省时、灵敏度较高的特点.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

鲜牛乳样品采自西安市未央区草滩奶牛场；鲜羊奶采自陕西省富平县金牛乳品公司；鲜奶于-20 ℃保存备用.纯羊奶粉、纯牛奶粉、全脂奶粉、乳清蛋白粉等市售奶类样品购自西安市不同的超市.

巴氏杀菌乳制作方法采用《NYT 939-2005 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》.

牛、羊引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，开盖前经4 000×g离心1 min，使DNA沉在底部，按其管上的OD值加相应的灭菌超纯水，稀释成100μmol/L，分装后再取适量稀释为10μmol/L -20 ℃保存备用，待PCR扩增备用.

1.1.2 主要仪器与试剂

(1)主要试剂：2×PCR Mix、DNA MarkerⅠ、快速DNA提取检测试剂盒、磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司.

(2)主要仪器：高速冷冻离心机(HC-2518R，杭州华创科学器材有限公司)；普通PCR仪(Bio-Rad，伯乐生命医学上海有限公司)；琼脂糖水平电泳仪(DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司)；电泳图像分析系统(FR-980A，上海复日科技有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取

液态乳DNA除脂采用黎颖等[19]除脂方法，并在此方法上略有改动，液态乳固体乳粉则先加水成为复原乳再依据上述方法.取10.0 mL上述处理好的乳样于离心管中(固体乳粉则称量40.0 mg，溶于10.0 mL蒸馏水中，混匀)，在4 ℃ 5 000×g离心30 min.除去离心管上层的乳脂，再次将乳混匀，10 000×g离心15 min，用小勺和无菌棉除去上层乳脂，如此重复两次.再用吸管将上清液吸出，保留最底部的沉淀，用无菌棉球擦除离心管壁上残存乳脂，用2 mL的PBS缓冲液溶解沉淀，并使之悬浮，10 000×g离心10 min，如此重复三次.最后将沉淀溶于500μL PBS缓冲液中悬浮(固体样品最终溶于200μL PBS缓冲液中，混匀)，备用.

快速DNA提取方法的建立：采用DNA提取检测试剂盒进行，并按试剂盒说明略作修改进行.取液体样品50μL(乳粉处理后样品为200μL)于1.5 mL的离心管中，加入100μL缓冲液B1(乳粉样品加50μL)，确保缓冲液可完全覆盖样品；用研磨杵将样品混匀捣碎；加入100μL缓冲液B2(乳粉样品加50μL)，振荡混匀，12 000×g离心2 min；小心吸取100μL上清液于另一干净的1.5 mL离心管中作为模板备用.

磁珠法提取DNA方法的建立：用磁珠法基因组DNA提取试剂盒进行，并按试剂盒说明略作修改进行.取样品400μL样品，加入20μL Proteinase K溶液；加入300μL裂解液GHL，振荡混匀；将离心管置于65 ℃，孵育60 min，期间颠倒混匀3回，每回3～5次；消化完成后置室温放置5 min，再加入350μL异丙醇，振荡混匀10 s后加入20μL磁珠悬浮液G，振荡混匀1 min，共静置9 min，每3 min振荡混匀1 min.将离心管放于磁力架上静置30 s，待磁珠完全吸附后，小心移去液体；取下离心管，加入700μL GDA缓冲液与无水乙醇的混合物(1∶4)，振荡混匀5 min；再置磁力架上静置30 s，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入700μL PWD漂洗液与无水乙醇的混合物(1∶1)，振荡混匀2 min；重复上一步骤，室温晾干后加入100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56 ℃孵育10 min后将其静置于磁力架上，待磁珠完全吸附将DNA溶液转移至一个新的离心管中，并于4 ℃保存.具体操作按试剂盒说明进行.

1.2.2 引物的选取

本课题涉及到的牛羊源性引物，经查找资料，以线粒体12S rRNA的保守序列设计特异性引物，牛乳和羊乳源性成分扩增选取已报道的引物分别来自Bottero等[20](2003).引物序列如表1所示.

表1 本实验中PCR扩增引物序列

1.2.3 PCR扩增

双重 PCR 体系和反应程序如下：PCR 总反应体系为 25μL；其中模板 DNA 2μL，2×PCR Mix 12.5μL，牛和羊的上下游引物(10μmol/μL)各0.5μL，ddH2O 8.5μL.PCR 反应程序为：94 ℃预变性3 min， 94 ℃变性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃后延伸10 min；-20 ℃保存.

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳

配制2.5%琼脂糖凝胶，调整电泳仪电压50 V，电泳约120 min，经EB染色30 min，灭菌双蒸水脱色10 min，置凝胶成像分析系统观察结果.本文所有实验均重复三次.

2 结果与讨论

2.1 双重PCR体系的建立

对鲜牛乳及鲜羊乳按照除脂、提取DNA、PCR扩增、电泳等操作方法进行以验证该方法的灵敏度和选取引物是否合理.其结果如图1所示.

M：100 bp Marker；1～2：鲜牛乳；3～4：鲜羊乳；-：双蒸水空白对照图1 牛羊乳的双重PCR电泳方法验证实验

从图1可以清晰地看到，牛羊乳在256 bp和326 bp各自的条带，且牛乳的条带亮度要大于羊乳条带，原因可能是羊乳的蛋白质含量高于牛乳，在蛋白质消化过程中羊乳蛋白未完全消化，提取出的DNA含量较少，反之，牛乳加的缓冲液的量相对较多，应根据实验中具体沉淀物的含量来及时的调整试剂量的多少，以确保实验更加的准确.Rogrigues等[21]选取了牛300 bp和羊444 bp的引物扩增片段，条带暗且不如本研究中图1清晰.通过灵敏度试验，可以看出引物特异性良好，该方法具有较好的作为牛羊乳中DNA提取的检测依据.

2.2 模拟掺假样品中牛源性成分的检测

由于乳中DNA主要来自母体(牛或羊)的乳腺细胞里，含量低，且体细胞的数量又受多方面因素的影响，如，母体动物是否处于哺乳期、乳房健康状况、个体差异及环境的影响等[15,22]，故提取乳DNA的质量和纯度对后续实验的开展具有至关重要的作用.常见成本较低的DNA提取方法有有机溶剂提取法[21]，如利用苯酚-氯仿-异戊醇来逐级对细胞进行破碎来裂解蛋白质，最后因DNA与醇的相组成不同(DNA为水相，醇为有机相)而得以分离提取，但该方法使用大量有机溶剂，DNA损失较严重，适用于物质中高含量的DNA的提取，故本研究在此基础上利用快速DNA提取法和磁珠DNA提取法进行方法的对比研究.

在纯羊乳中分别掺入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的新鲜牛乳以此作为模拟样品来检测其牛源性成分，并以灭菌双蒸水为空白对照，进而判断检测限，并以此作为市售商品掺假的一个基本的检测依据.并对比两种DNA提取方法(快速DNA提取法和磁珠DNA提取法)的灵敏度及检测阈值的差别，实验结果如图2所示.

(a) 快速DNA提取法

(b) 磁珠DNA提取法M：100 bp Marker；1：纯鲜牛乳；2～7：掺入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的新鲜牛乳的新鲜羊乳；8:纯鲜羊乳；-：空白对照图2 羊乳中掺入牛乳的双重PCR检测

由图2可得出，快速DNA提取法最低可以检测到羊乳中10%的牛乳掺假，磁珠 DNA提取法最低可以检测到羊乳中1%的牛乳掺假.比较可知，使用磁珠DNA提取法检测阈值更低，电泳条带整齐而稳定，DNA提取质量较高，而前者虽操作简单省时，但蛋白质污染较验证，DNA纯度不高，故选用磁珠法进行后续的实验较为准确.

2.3 市售奶制品中牛源性成分的应用性检测

使用磁珠法对含有不同牛乳比例(掺入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的牛乳的巴氏杀菌羊乳)的巴氏杀菌羊乳进行检测，并以灭菌双蒸水为空白对照，其结果如图3所示.由图3可知，条带虽不如鲜乳的DNA稳定规则，但也可检测出掺入1%的牛乳成分.

M：100 bp Marker；1：纯巴氏杀菌牛乳；2～8：掺入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的牛乳的巴氏杀菌羊乳；-：空白对照图3 掺入牛乳的巴氏杀菌羊乳的双重PCR检测

为进一步验证方法的适用性，对四个市售不同品牌的羊奶粉样品，以纯牛羊奶粉作对照，应用建立的方法进行检测，其结果如图4所示.

图4显示，泳道2和5各有两个条带，显示了掺入了牛乳情况，而泳道3仅有牛DNA一个条带，显示了几乎全是牛乳，说明完全掺假，泳道4与泳道1一致，说明未掺假.本课题组在实验室对多个品牌的液态羊乳、全脂奶粉、脱脂奶粉及婴幼儿配方奶粉等16个产品进行了检测，其中网上选购的8个羊乳掺假产品占半数以上，而从羊乳产业大省的陕西本地购买的8个羊乳商品掺假情况则不超过四分之一，故从实际市售样品检测结果来看，为了保护消费者及诚信厂家的权益，羊乳制品的保真性检测非常有意义.

3 结论

本文建立了以牛羊线粒体DNA上的12S rRNA为靶基因而设计针对牛羊特异性的片段的双重PCR检测方法，并以快速法和磁珠法对比，得出使用磁珠法的灵敏度高，DNA纯度较高.此前的研究中，磁珠法多用于提取血液中DNA，本文则首次用该法提取具有复杂的乳成分体系的乳中的DNA，且结果显示，在鲜羊乳及巴氏杀菌羊乳中最低能检测出掺有1%的牛乳的成分，并能直观检测出市售羊奶粉的掺假情况，说明经过一系列加工的奶粉中DNA依然能够稳定存在，为乳品掺假提供了一个可行的方法.

双重PCR因其可以同时对两对引物来扩增两个目的片段，对食品中掺入一个组分来进行特异性检测，操作方便直观，灵敏度高，商业性掺假从利益与风险两方面考虑，一般以5%为限度，本研究1%检测阈值已足够掺假监控检测的要求.但如何应对乳品多组分掺假(非乳源性)的引物设计要求更高，如何化解受电泳样品数限制的大规模普查要求，基于此不足之处，今后应在双重PCR的基础上，建立多组分食品掺假的多重PCR技术及考虑大规模实际应用的荧光定量PCR技术的检测方法，进一步为乳品掺假的监管提供一个方便快捷的技术.

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