三剂量浊度法庆大霉素效价测定的不确定度分析

韩宁宁 , 戴 青 , 于丽娜 , 王静文 , 徐 嫄 , 赵 晖

(中国兽医药品监察所 ， 北京 海淀 100081)

效价测定的三剂量法一般应用于抗生素类标准品制备的标定赋值。由于该方法为生物检定法，操作步骤繁多，影响因素众多。如何提高标准品赋值的准确性是标准品制备者所关心的问题之一。本文根据《测量不确定度评定与表示》(JJF1059.1—2012)[1]中有关规定，以三剂量浊度法测定庆大霉素原料效价为例，对该方法的不确定度来源和大小进行分析及评定，从而为评价赋值结果提供科学依据，也为提高赋值准确性指引方向。

1 仪器与试药

1.1 仪器 WBS-100微生物比浊法测定仪(北京先驱威锋技术开发公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 菌株、样品、培养基与试剂 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003(中国食品药品检定研究院)。庆大霉素标准品(来源/批号/含量：中国兽医药品监察所/K0071502/630单位/mg)。庆大霉素原料药(来源/批号/估计效价：烟台只楚药业有限公司/160310073/600单位/mg)。抗生素检定III号培养基、pH值7.8的磷酸盐缓冲液、生理盐水及灭菌水均由北京中海生物科技有限公司提供配制。

2 方法

根据中华人民共和国兽药典二〇一五年版一部附录抗生素微生物检定法[2]，对该批庆大霉素原料进行三剂量浊度法的效价测定。

检定菌株CMCC(B)26003处理方法为营养琼脂大试管(3 cm×15 cm)培养22 h后用6 mL生理盐水洗脱，将该菌悬液用生理盐水进行1∶10稀释，得稀释菌悬液，抗生素检定III号培养基菌悬液浓度为稀释菌悬液的0.2%。

庆大霉素标准品及原料药的稀释过程均为取适量样品，精密称定，置25 mL量瓶(V1)中，加水溶解并稀释至刻度，配制成1 000单位/mL溶液。用5 mL移液管(V2)精密量取上述溶液5.00 mL置100 mL量瓶(V3)中，加pH值7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，得50单位/mL的溶液。用5 mL移液管(V4)精密量取上述溶液5.00 mL置100 mL量瓶(V5)中，加pH值7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，得2.5单位/mL的溶液。用5 mL刻度吸管(V6)分别量取上述溶液5.0、4.0、3.2 mL置50 mL量瓶(V7)中，加pH值7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，分别得0.25、0.2、0.16单位/mL的溶液。

用微量移液器各移取上述溶液1.00 mL(V8)置比色皿中。之后每个比色皿中用10 mL刻度吸管(V9)加入带菌培养基9.0 mL，盖上盖子，置预热至37 ℃的微生物比浊法测定仪中培养3～4 h，待符合要求[3]平均可信限率≤7.0%，回归具有显著性差异(P<0.01)，偏离平行不具有显著性差异(P>0.05)，二次曲线不具有显著性差异(P>0.05)，反二次曲线不具有显著性差异(P>0.05))时，打印报告。

3 结果与分析

S2、S3分别为标准品低、中、高浓度所有吸光度值的总和；T1、T2、T3分别为供试品低、中、高浓度所有吸光度值的总和；I为高浓度与中浓度或中浓度与低浓度比值的对数，在三剂量法中I=log1.25=0.096 9。

由Pt=P×D×At导出如下公式：u2(Pt)rel=u2(P)rel+u2(D)rel+u2(At)rel(公式1)。

u(P)rel由仪器对吸光度值的重复测量及稀释过程中移液管、刻度吸管、微量移液器、量瓶的标准操作而产生；u(D)rel及u(At)rel由天平称量的标准操作而产生。

3.2 各分量的不确定度

3.2.1 运算系数P的相对标准不确定度u(P)rel运算系数P的不确定度u(P)rel的来源有3个：吸光度值重复测量引入的不确定度u测量1、仪器最大允许误差引入的不确定度u测量2和稀释过程的标准操作引入的不确定度u(I)。故u2(P)rel=u2测量1rel+u2测量2rel+u2(I)rel(公式2)。

3.2.1.1 仪器对吸光度值的重复测量引入的不确定度

本试验测得高中低浓度标准品和供试品各吸光值如表1所示。效价测定结果为639单位/mg。

在三剂量法中，由于每份报告是由n个平行样组成，吸光度重复测量引入的不确定度分量为实际

表1 三剂量浊度法测定庆大霉素原料吸光度值

其相对标准不确定度u测量1rel=u测量1/y=0.155/639=2.43×10-4

3.2.1.2 供试品与标准品稀释过程中的标准操作引入的不确定度

u(I)2rel=u(V1)2rel+u(V2)2rel+u(V3)2rel+u(V4)2rel+u(V5)2rel+u(V6)2rel+u(V7)2rel+u(V8)2rel+u(V9)2rel(公式3)。

u(V4)rel=u(V5)rel=u(V2)rel=1.77×10-3；

代入公式(3)得：u(I)rel=1.10×10-2。

代入公式(2)得：u(P)rel=1.11×10-2。

3.2.2 标准品实际浓度与理论浓度的比值D的相对标准不确定度u(D)rel

代入公式(4)得u(D)=4.83×10-2。标准品的称样量为39.85 mg，故u(D)rel=u(D)/39.85=1.21×10-3。

3.2.3 供试品的估计效价引起的相对标准不确定度 u(At)relu(At)为供试品称量过程中的标准操作引起的不确定度。其计算方法与3.2.2公式(4)相同。供试品的称样量为41.98 mg，故u(At)rel=u(At)/41.98=1.15×10-3。

3.3 合成相对标准不确定度及扩展相对不确定度的计算 将上述各值代入公式(1)得u(Pt)rel=0.011。实验所得庆大霉素原料的效价为639单位/mg，则测量结果的合成相对标准不确定度为U(Pt)=0.011×639=7单位；取包含因子k=2，则测定结果的扩展相对不确定度为U=2×7单位=14单位。庆大霉素原料的测定结果可以表示为639±14单位，k=2。

4 讨论

4.1 各分量对测量准确度的影响 比较各不确定度分量可知，u(P)rel>u(D)rel≈u(At)rel，而u(P)rel中，u(I)rel所占不确定度分量较大，提示影响测量准确度的主要因素为稀释过程的标准操作。因此，标准品制备标定人员应注意效价测定过程中稀释定容的操作手法，并保证供试品与标准品的手法一致性。

4.2 本试验不确定度分析中的零项[6]三剂量浊度法效价测定中各比色皿的加样顺序一般为S3→T3→S2→T2→S1→T1，同时要求加入抗生素溶液后立即快速加入含有菌悬液的培养基，以避免在不同比色皿中细菌的生长时间差异引起培养基吸光度值的差异。在本试验操作中，还注意将培养基预先放置于5 ℃冰箱冷藏以进一步抑制试验开始前细菌的生长。故加样顺序导致的时间差异做零项处理。

WBS-100型微生物比浊法测定仪温度均匀度为±0.3 ℃。采用国际通行的拉丁方阵排列比色皿，可消除不同位置的温度差异，避免系统误差。故培养温度的差异做零项处理。

[1] 国家质量监督检验检疫总局. 测量不确定度评定与表示[S]. JJF1059.1-2012, 2012.

[2] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典[S]. (2010年版一部). 北京: 中国农业出版社, 294-296.

[3] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典[S]. (2015年版一部). 北京: 中国农业出版社, 352-355.

[4] 国家质量监督检验检疫总局. 常用玻璃量器检定规程[S]. JJG196-2006, 2006.

[5] 国家质量监督检验检疫总局. 电子天平检定规程[S]. JJG1036-2008, 2008.

[6] 常艳. 抗生素标准品的定值及其不确定度评定[D]. 北京: 北京协和医学院研究生院, 2011.