齐墩果酸对铅暴露小鼠脑组织氧化损伤及7种矿物质元素的影响

郗艳丽 ， 吴启坤 ， 魏振奇 ， 郑晓娟 ， 刘正阳 ， 李 澍 ， 王 迪 ， 王舒然

(吉林医药学院公共卫生学院 ， 吉林 吉林 132013)

铅是一种物质蓄积性毒物，摄入后会使机体发生多种生理变化，产生毒性效应。铅的毒性效应与其在机体内的半衰期较长有关。当铅的代谢速度低于吸收速度时，随着接触剂量的增加或者接触时间的延长，机体内的铅水平会不断增加，达到亚临床水平就会对机体组织产生不利影响。此外，铅还是一种多亲合性毒物，对全身组织器官有广泛的亲和力，其中神经系统最易因铅暴露损伤。相对于成年人，儿童的神经系统对铅的敏感性更高，会导致儿童出现多动、注意力不集中、记忆力下降、忧郁、烦躁等临床症状，严重的还会影响儿童智力的发育[1-2]。研究发现，儿童的血铅水平越高，对智力的影响越大，血铅水平与智商IQ呈负相关[3]。铅会使组织细胞的氧化还原反应发生改变并生成大量的自由基，自由基堆积引起的氧化损伤是铅导致神经系统中毒的重要作用机制之一[4-5]。齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)是木犀科植物女贞子中的有效活性成分，其对DPPH自由基的清除率可达到70.96%，对过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)诱导的人气道平滑肌细胞株ASMC氧化损伤有保护作用，对氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉血管内皮细胞株HUVECS氧化损伤也有保护作用[6-8]。齐墩果酸对自由基的清除能力表明其对铅暴露引起的神经系统损伤也会有影响，但关于这方面的研究未见报道。本文就齐墩果酸对铅暴露小鼠脑组织中H2O2、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量进行分析，同时观察脑组织中铅含量，分析齐墩果酸与脑组织铅含量及氧化应激指标之间的关系，为齐墩果酸对铅所致神经系统毒性影响的机制探讨提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 齐墩果酸(西安文竹生物科技有限公司)；醋酸铅(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；硝酸(北京市北辰骅跃化学试剂厂)；氧化镧(郑州生裕化工产品有限公司)；锌、锰、铜和镁标准储备液(天津市光复精细化工研究所)；铅、钙和铁标准储备液(中国计量科学研究院)；H2O2、NOS、CAT、NO、SOD和MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)； T10高速组织分散机(IKA公司)；TAS-990原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)； Synergy H1M 酶标仪(BioTek 公司)；MARS6微波消解仪(美国CEM公司)；BS224S-CW电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；24UV 超纯水器(美国Millipore 公司)；IMS-40全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；5430R高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理 40只刚断乳昆明系小鼠，购自长春生物制品研究所有限责任公司，生产许可证号：SCXK(吉)2011-0007，体重13～16 g，饲养于吉林医药学院实验动物中心，合格证号：SYXK(吉)2012-0004。饲养条件：温度18 ℃～22 ℃，湿度45%～65%，12 h明暗交替。按体重随机分为对照组、醋酸铅模型组、齐墩果酸组和齐墩果酸+醋酸铅组，每组10只，雌雄各半。对照组按0.1 ml/10 g体重给予豆油溶液灌胃，饮用自来水；模型组按体重给予0.1ml/10 g豆油溶液灌胃，用2 g/L醋酸铅溶液(添加少许醋酸以防止产生絮状沉淀)作饮用水造模；齐墩果酸组按0.1ml/10g体重给予1 g/L齐墩果酸豆油溶液灌胃，饮用自来水；齐墩果酸+醋酸铅组按0.1 ml/10 g体重给予1 g/L齐墩果酸豆油溶液灌胃，用2 g/L醋酸铅溶液作饮用水。模型组和齐墩果酸+醋酸铅组饮用醋酸铅水造模1周后，各组每天分别给予豆油溶液和齐墩果酸豆油溶液灌胃1次，同时用醋酸铅作饮用水。对照组和齐墩果酸组给予自由饮水1周后，给予豆油溶液或者齐墩果酸豆油溶液每天灌胃1次。连续灌胃3周后用自来水代替醋酸铅作为饮用水并禁食过夜，称重后处死小鼠，取出脑组织进行指标检测。

1.2.2 微波消解处理和测定 准确称取0.2 g新鲜脑组织，剪碎后移入反应罐中，加入5 mL硝酸，用微波消解仪进行消化处理(400 W升温5 min，120 ℃消解5 min，800 W升温5 min，150 ℃消解10 min，800 W升温10 min，180 ℃消解10 min)。将冷却至室温的消解液定容至10 mL，同时设置只加消化液和稀释液的空白对照组。用石墨炉原子吸收分光光度法测定铅的吸光度，火焰原子吸收分光光度法测定钙、铁、锌、铜、镁和锰的吸光度，并用标准曲线法计算出各元素的含量。

1.2.3 CAT、H2O2、NOS、NO、SOD和MDA含量的测定 把剩余新鲜脑组织与生理盐水按1∶9的比例混合后匀浆成悬浊液并离心，取上清液进行H2O2、CAT、NO、NOS、SOD和MDA的测定，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 各试验组小鼠体重、脑组织质量及其系数变化 试验初始时每组共有小鼠10只，试验结束时每组小鼠剩余10只。铅暴露并未引起小鼠死亡，齐墩果酸经口灌胃也未引起小鼠死亡。小鼠初始体重均值为(14.50±1.56)g，试验结束时各组小鼠体重均有增加，但各组体重差异不明显(P>0.05)。试验中各组小鼠营养状况良好，被毛光泽，体温及呼吸频率正常。试验结束后处死小鼠，取脑组织并用生理盐水洗去血污，滤纸蘸干水分后称重。通过计算脏器系数发现铅暴露并未引起脑组织质量改变。齐墩果酸组以及齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织脏器系数与对照组相比较，也未发现有明显差异(P>0.05)。这表明齐墩果酸对小鼠脑组织质量也未产生明显影响(见表1)。

表1各试验组小鼠终末体重、脑组织质量及脏器系数

组别小鼠终末体重(g)脑组织湿重(g)脑脏器系数(%)对照组18.73±1.310.4662±0.322.50±0.21醋酸铅模型组20.78±2.300.4599±0.452.24±0.37齐墩果酸组19.01±2.820.4621±0.282.47±0.32齐墩果酸+醋酸铅组18.79±2.270.4651±0.252.49±0.18

2.2 各试验组小鼠脑组织铅、钙、锌和锰含量变化 由表2可知，醋酸铅模型组小鼠脑组织铅含量明显高于对照组(P<0.05)，这一结果表明，醋酸铅模型组造模成功。齐墩果酸组小鼠脑组织铅含量明显低于醋酸铅模型组(P<0.05)，齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织铅含量低于醋酸铅模型组(P<0.05)。这一结果表明，小鼠给予齐墩果酸后降低了小鼠脑组织铅含量。醋酸铅组小鼠脑组织钙含量明显低于对照组(P<0.05)，齐墩果酸组和齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织钙含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。齐墩果酸组小鼠脑组织钙含量高于醋酸铅模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)。齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织钙含量明显高于醋酸铅模型组，且差异有统计学意义(P<0.05)。这表明齐墩果酸对钙含量没有影响，但却可以降低铅对钙的影响。在各试验组小鼠脑组织中，锌和锰含量没有发生明显改变(P>0.05)。

表2 各试验组小鼠脑组织铅、钙、锌和锰含量

注：与对照组比较，*P<0.05； 与醋酸铅模型组比较，#P<0.05，表4同

2.3 各试验组小鼠脑组织铜、镁和铁含量变化 如表3所示，与对照组比较，醋酸铅模型组、齐墩果酸组和齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织铜、镁和铁的含量变化无统计学意义(P>0.05)。与醋酸铅模型组比较，齐墩果酸组和齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织铜、镁和铁含量的变化均无统计学意义(P>0.05)。与齐墩果酸组比较，齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织这3种元素含量变化差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 各试验组小鼠脑组织铜、镁和铁含量

2.4 各试验组小鼠脑组织H2O2、CAT、NO和NOS含量变化 如表4所示，与对照组比较，醋酸铅模型组小鼠脑组织H2O2和CAT水平明显降低，NO和NOS水平显著升高，且差异有统计学意义(P<0.05)，齐墩果酸组和齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织H2O2、CAT、NO和NOS水平无明显变化(P>0.05)。与醋酸铅模型组比较，齐墩果酸组小鼠脑组织H2O2和CAT水平明显升高，NO和NOS水平明显降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织H2O2和CAT水平明显降低(P<0.05)，NO和NOS水平没有明显变化(P>0.05)。齐墩果酸+醋酸铅组小鼠脑组织H2O2、CAT、NO和NOS水平与齐墩果酸组比较也没有明显差异(P>0.05)。

2.5 各试验组小鼠脑组织SOD和MDA含量变化 如表5所示，与对照组比较，醋酸铅模型组小鼠脑组织SOD水平明显降低(P<0.05)，MDA水平明显升高(P<0.05)。齐墩果酸组小鼠脑组织SOD和MDA水平与对照组比较没有明显差别(P>0.05)。齐墩果酸组小鼠脑组织SOD水平明显高于醋酸铅模型组(P<0.05)，MDA水平明显低于醋酸铅模型组(P<0.05)。齐墩果酸+醋酸铅组小鼠SOD水平低于对照组(P<0.05)，但明显高于醋酸铅模型组(P<0.05)；MDA水平高于对照组和齐墩果酸组(P<0.05)，但明显低于醋酸铅模型组(P<0.05)。

表4各试验组小鼠脑组织H2O2、CAT、NO和NOS含量

组别H2O2(mmol/g)CAT(U/mg)NO(Umol/g)NOS(U/mg)对照组80.55±10.160.80±0.171.29±0.440.44±0.17醋酸铅模型组65.60±6.00*0.58±.22*2.24±0.40*0.63±0.13*齐墩果酸组81.21±11.89#0.83±0.18#1.46±0.26#0.43±0.08#齐墩果酸+醋酸铅组78.94±11.48#0.75±0.31#1.85±0.340.57±0.05

表5 各实验组小鼠脑组织SOD和MDA含量

注：与对照组比较，*P<0.05；与醋酸铅模型组比较，#P<0.05；与齐墩果酸组比较，▼P<0.05

3 讨论

铅是一种在工业和日常生活中被广泛应用的重金属，广泛分布在水、土壤、空气和食物中，可以通过呼吸道、消化道和皮肤吸收。进入机体的铅对神经系统、骨骼系统、造血系统、免疫系统等有明显毒性，其中对神经系统的毒效应最强[9]。发育中的神经系统对铅暴露非常敏感。铅暴露造成的脑发育异常具有持久且不可逆的特性。铅对神经系统发育的诱导，细胞的增殖、迁移、分化，突触形成和神经元回路建立以及神经细胞坏死等过程都会产生影响，可导致儿童神经行为以及智力改变，严重的可导致痴呆[10]。铅的神经毒性防治研究具有重要的科学价值。本研究通过给予刚断乳小鼠饮用醋酸铅水的方式模拟儿童发育阶段的铅暴露，同时给予齐墩果酸干预，观察处理后小鼠脑组织铅含量以及钙、铁和锌等元素的变化，观察齐墩果酸对铅暴露小鼠的影响，为防治铅中毒提供理论依据。

通过观察发现，醋酸铅饮水造模4周后，小鼠脑组织铅含量明显高于对照组，这表明铅暴露模型造模成功。通过齐墩果酸干预3周后发现，齐墩果酸能降低脑组织中铅含量，有较好的排铅作用。此外，齐墩果酸干预后升高了铅暴露引起的脑组织钙水平降低。钙与铅同为二价阳离子，在体内有相似的代谢过程，铅可以占据电压依赖性钙通道而抑制钙转运，导致钙无法被运输而水平降低。由于铅的占用，许多钙通道会永久失活，造成不可逆性改变[11]。齐墩果酸对钙含量的影响表明其可能逆转了钙通道被铅占用，减少了钙的丢失。

除了钙以外，本研究还观察了铁、锌、铜、镁和锰元素在脑组织中的变化。这些元素在体内都有重要功能，其含量高低直接关系到人体健康。铁是血红蛋白的主要成分[12]，锌是多种解毒酶的功能成分或激活剂，铜可参与造血和铁的代谢，镁是多种酶的辅助因子，锰在体内一部分作为金属酶的组成成分，一部分作为酶的激活剂发挥作用[13-14]。铅暴露可以影响这5种元素的转运，引起元素代谢的紊乱。本研究发现铅暴露后并未引起小鼠脑组织中这5种元素含量的改变，这表明铅暴露4周，尚不足以引起脑组织中这些元素发生紊乱。齐墩果酸干预也未明显改变这些元素在脑组织中的含量。

铅对神经系统的损伤作用与铅诱导产生大量自由基有关。体内自由基包括活性氧自由基和活性氮自由基，其中H2O2是活性氧自由基的典型代表，NO是活性氮自由基的典型代表。由自由基引起的蛋白质损伤与神经退行性疾病的发生有关。酶抗氧化系统被抑制以及自由基的大量生成共同导致了神经系统受损。H2O2可以与体内二价金属离子发生Fenton反应，生成毒性更强的羟自由基(hydroxyl free radical，·OH)。本研究发现，同样为二价金属的铅大量进入机体，在诱导H2O2大量生成的同时也消耗掉了H2O2，生成了毒性更强的自由基，这可能是导致醋酸铅模型组小鼠脑组织中H2O2水平比对照组低的原因。·OH的大量生成会进一步加重脑组织的氧化损伤。CAT是机体内负责清除H2O2和·OH的主要活性酶之一，大量生成的自由基诱发了氧化应激，导致解毒酶CAT的活性降低，自由基无法被及时清除而大量堆积，氧化损伤进一步加重。齐墩果酸降低了脑组织中铅含量，减轻了H2O2生成量以及铅与H2O2反应生成·OH的量，因此齐墩果酸+醋酸铅组脑组织H2O2水平比醋酸铅组高，但比对照组低。齐墩果酸通过升高CAT的水平实现了降低铅对脑组织的损伤。醋酸铅模型组NO水平比模型组高，这表明铅对脑组织产生损伤的过程中，活性氮自由基也发挥了重要作用。此外，本研究还发现，醋酸铅模型组NOS的活性比对照组高，这可能与NOS是调控NO生成的酶有关。齐墩果酸有较强的抗氧化作用，可以清除体内产生的NO自由基。因此，齐墩果酸+醋酸铅组NO水平低于醋酸铅模型组，NOS的水平也低于醋酸铅模型组。齐墩果酸通过抗氧化作用降低了铅损伤，对脑组织起到了保护作用。

综上所述，齐墩果酸对铅所致小鼠神经系统损伤具有一定的保护作用，其降低自由基引起氧化损伤的同时，对铅暴露所导致的钙流失也有抑制作用，但对锌、铁、锰、镁和铜元素的影响不大。齐墩果酸具有能改善铅毒性引起的氧化损害，对其他元素在体内的代谢影响小以及本身的毒性作用小等优点，可以作为一种优良的天然防治铅损害的功能活性物质被开发利用。

[1] 王敏,田丹,周志忠,等. 铅中毒对国内儿童智力发育影响的Meta分析[J]. 中南医学科学杂志,2012,40(1):36-41.

[2] 陈易林,于德娥,魏青,等.出生后铅暴露对大鼠海马突触结构可塑性的影响[J].卫生研究,2012,41(3):394-398.

[4] 张季,严春临,王博奥,等. 苦荞麦多糖对铅中毒小鼠的保护作用研究[J]. 现代食品科技,2015,31(7):12-17+11.

[5] 刘芳丽, 薛振菲, 张楠,等. 白藜芦醇对铅诱导小鼠脂质过氧化的拮抗作用[J].卫生研究,2012,41(6):920-924.

[6] 郗艳丽,张啟娟,周婧,等.女贞子中齐墩果酸提取工艺优化[J]. 食品研究与开发,2015,36(20):36-40.

[7] 蓝海兵,罗亮,陈玉,等. 齐墩果酸对体外培养的人气道平滑肌细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国临床药理学与治疗学,2015,20(9):971-975.

[8] 王道艳,王志,张峥,赵慧慧,等. 齐墩果酸对oxLDL诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用[J]. 青岛大学医学院学报,2014,50(6):487-489+492.

[9] Gąssowska M, Baranowska-Bosiacka I, Moczydowska J,etal. Perinatal exposure to lead (Pb) promotes Tau phosphorylation in the rat brain in a GSK-3β and CDK5 dependent manner:Relevance to neurological disorders[J].Toxicology,2016,10:347-349.

[10] 雷洁, 古桂雄.铅对脑发育的损伤[J].国外医学妇幼保健分册,2002,13(1):33-34.

[11] 汪慧琼,黄永平,刘建文,等. 铅神经毒性机制及神经保护药物的研究进展[J]. 毒理学杂志,2015,29(3):222-226.

[12] 王文祥,董凤,李晓棠,等.大豆异黄酮对幼鼠卵巢钙铁锌含量影响[J]. 中国公共卫生, 2015, 25(8):1 050-1 052.

[13] 葛亚龙,唐志华. 微量元素与人体健康[J]. 饮料工业,2013,16(3):4-6.

[14] 闫小艳. 微量元素的平衡与人体健康[J]. 新西部(理论版),2011,10:195-196.