葛根连芩提取液对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究

汪 志 ， 孙彦阔 ， 陈 耀 ， 冯松林 ， 冀池海 ， 刘乙兴 ，李 琪 ， 王少君 ， 张桂红

(1.华南农业大学兽医学院 ， 广东 广州 510642 ； 2. 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室 ， 广东 广州 510642)

猪繁殖与呼吸综合征，俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引发的急性、高度传染性的病毒性疾病，每年给世界养猪业带来巨大的经济损失。该病典型的临床症状为妊娠母猪繁殖障碍和仔猪产生呼吸道疾病。目前防控蓝耳病的主要手段是疫苗免疫，临床上暂时尚未出现针对该疾病的特效药物[1]。

中药发源于中国，是中医预防和治疗疾病的特色药物，是历经了几千年的智慧的结晶。随着科学的发展以及研究的深入，中药越来越受到人们的重视。我国中草药资源丰富，不仅用于人类疾病的治疗，在畜禽疾病的防控方面也逐渐显示出独特的优势[2-4]。本文以葛根连芩提取液为药物来研究其体外抗PRRSV的抗病毒作用，旨为猪繁殖与呼吸综合征特效药的研究提供素材。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂 葛根连芩提取液，购自北京康牧生物科技有限公司；DMEM细胞培养基，胎牛血清FBS，胰蛋白酶(0.25%)，PBS缓冲液，CCK-8试剂盒(产品批号：D3100L4054)。

1.2 病毒与细胞 本研究用到XH-GD PRRSV和Marc-145细胞，均保存于华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室。

1.3 主要仪器与设备 CO2培养箱(RS生物工程有限公司)；DMI4000 B共聚焦荧光显微镜(Leica公司)；微量移液器(Eppendorf公司)；净化工作台SW-CJ-2F，苏州净化设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 葛根连芩提取液及DMSO对Marc-145细胞毒性测定 葛根连芩提取液为两种类型的样品，即样品1与样品2。样品1中葛根连芩提取液与DMSO的比例为1∶2，样品2 中葛根连芩提取液与DMSO的比例为1∶1。按照药物与DMSO的比例进行换算，分别配制原液药物稀释倍数为1∶100、1∶500、1∶1 000，使用cck8试剂盒进行细胞毒性测定。同样方法测定DMSO对细胞增殖的影响。

1.4.2 XH-GD PRRSV毒株TCID50测定 取出96孔细胞培养板，进行Marc-145细胞传代培养，每个孔的细胞长至约60%即可接种病毒。采用10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，每个梯度做5个重复。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100 μL。在37 ℃细胞培养箱孵育1 h后弃去病毒液，加入细胞维持培养液(含2%血清)，每天观察细胞病变(CPE)，根据Reed-Muench公式计算病毒的TCID50。

1.4.3 葛根连芩提取液对PRRSV的阻断作用及间接免疫荧光试验 取出24孔细胞培养板，进行Marc-145细胞传代培养，待细胞长满单层后，分别加入1∶250、1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀释的药物500 μL，每个梯度4个重复。将细胞培养板置于37 ℃培养箱孵育2 h后，弃去药物，每孔加入100 TCID50PRRSV病毒液500 μL，置于37 ℃细胞培养箱孵育。2 h后弃去细胞培养板的病毒液，加入细胞维持培养液，置于37 ℃细胞培养箱孵育，试验中设立不加药物的病毒阳性对照。48 h后收取细胞培养液并进行各浓度的病毒TCID50测定。

取出24孔细胞培养板，进行Marc-145细胞传代培养，待细胞长满单层后，接种阻断作用收集的病毒液，并设立阴性对照。置于37 ℃细胞培养箱中孵育48 h，然后弃去病毒液。用PBST洗涤细胞板3次，再加入500 μL的多聚甲醛溶液固定细胞，置于4 ℃孵育，15 min后弃去多聚甲醛，用PBST洗涤细胞板3次。加入500 μL稀释后的抗PRRSV N蛋白单抗，于37 ℃培养箱中孵育。2 h后弃去首抗，用PBST洗涤细胞板3次，加入500 μL稀释狗的罗丹明标记的抗鼠的二抗，于37 ℃培养箱中孵育。1 h后弃去二抗，用PBST洗涤细胞板3次后，在荧光显微镜下观察结果。

1.4.4 葛根连芩提取液对PRRSV的抑制作用及间接免疫荧光试验 取出24孔细胞培养板，进行Marc-145细胞传代培养，待细胞长满单层后，每孔加入100 TCID50PRRSV病毒液500 μL，置于37 ℃细胞培养箱孵育。2 h后弃去病毒液，分别加入1∶250、1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀释的药物500 μL，每个梯度4个重复。将细胞培养板置于37 ℃培养箱孵育，弃去细胞板的药物液体，加入细胞维持培养液，置于37 ℃细胞培养箱孵育，试验中设立不加药物的病毒阳性对照。48 h后收取细胞培养液并进行各浓度的病毒TCID50测定。

抑制作用的间接免疫荧光试验实验操作同步骤1.4.3。

2 结果

2.1 葛根连芩提取液及DMSO对Marc-145细胞毒性测定结果 样品1与样品2及DMSO的试验结果如表1和图1。

本试验中药物浓度是指原液的稀释倍数，样品1三种梯度稀释后(100→1 000)的DMSO浓度分别为1%、0.2%、0.1%，样品2三种梯度稀释后(100→1 000)的DMSO浓度分别为0.5%、0.1%、0.05%。

由表1和图1试验结果得知，DMSO浓度在1%以下时对细胞的增殖不产生影响，经检测样品2在1∶500稀释之后的细胞存活率高，故选择样品2进行接下来的细胞PRRSV抗病毒试验。

表1 cck8测试细胞存活率

注：细胞存活率=[(OD值药物-OD值空白对照)/(OD值阴性-OD值空白对照)] × 100%

图1 细胞存活率

2.2 XH-GD PRRSV毒株的TCID50测定 利用Reed-Muench两氏法计算病毒TCID50，结果为：TCID50=10-5.5，即将病毒悬液作10-5.5稀释后，接种细胞0.1 mL，可以使50%的细胞产生CPE。

2.3 葛根连芩提取液对PRRSV的阻断作用及间接免疫荧光试验 在葛根连芩提取液1∶250和1∶500稀释倍数时，间接免疫荧光试验未检测到荧光(图3)，病毒毒力测定时也未检测到病变，则在此稀释倍数下可能使得细胞具有极强的抗感染能力，病毒未能够感染细胞；1∶1 000稀释倍数、1∶2 000稀释倍数与阳性对照间呈现明显递增趋势(图2)，说明该药物能够阻断PRRSV毒力。

图2 阻断作用病毒毒力测定

图3 药物阻断作用荧光图

2.4 葛根连芩提取液对PRRSV的抑制作用及间接免疫荧光试验 由间接免疫荧光试验结果得知，各个药物稀释倍数间荧光差异不明显(图5)；然后进行各个稀释倍数TCID50测定时，病毒毒力差异亦不明显(图4)。故该药物无法抑制PRRSV毒力。

图4 抑制作用病毒毒力测定

图5 药物抑制作用荧光图

3 讨论

目前，许多病毒性疾病没有特效药，严重制约着养殖业的发展。中草药植物中有着大量的活性因子，而且资源丰富，是理想的抗病毒药物筛选库。随着生物技术的逐渐成熟，中草药的功能研究成为热点。Karuppannan等发现包括乌本苷在内的10多种中药具有体外抗PRRSV作用[5]。Kim和Lee研究发现利巴韦林能够抑制PRRSV的复制，从而达到抗病毒的效应[6]。还有其他文献提出板蓝根、金银花和山药等众多中草药对PRRSV有着良好的抗病毒作用[7-9]。

葛根连芩在中医上用于治疗菌痢、肠伤寒等疾病，并取得了良好的效果[10]。有研究表明，葛根连芩能够抑制小圆结构病毒和脊髓灰质病毒的增殖，对轮状病毒有抗病毒作用，对轮状病毒腹泻患者有较好的临床效果[11]。

本试验以葛根连芩提取液为药物，在Marc-145细胞上研究其对PRRSV体外抗病毒作用。在阻断作用和抑制作用两个方向探究药物的抗病毒效应，结果显示，葛根连芩提取液对PRRSV有着明显的阻断作用，而抑制效果不理想。阻断作用的过程中，是先加入药物后加病毒，因此药物可能与细胞膜作用，减弱病毒与受体的结合能力，增强了细胞对PRRSV的抗感染能力。葛根连芩提取液具体的抗病毒机制以及在临床上的应用尚待进一步研究。

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