结核菌检测技术联合运用于结核病诊断及耐药结核病诊断的研究

戚超群 尹作梅

（1临沂市人民医院检验科 山东 临沂 276034）

（2临沂市中心血站 山东 临沂 276034）

结核病作为一种传染病，它的流行要具备三个条件：传染源，传播途径，易感人群。我国早在1982年就已经实施出生的婴幼儿接种卡介苗来保护结核菌易感人群，然而，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率，艾滋病等的发病率呈逐年上升的趋势，严重降低了人群对结核菌的抵抗力；结核病的传播途径为呼吸道飞沫传播，随着社会的发展，交通的便捷，人流物流都在加快，传播途径也不容易阻断；因此，控制传染源已经完全成为控制结核病的有效手段。2016年，全国有95万人患结核病，死亡1600人之多[1]；耐药结核病，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）更是结核病控制的重大威胁。本研究采用多技术联合的方法同时进行检测，分析方法的敏感性、特异性及检出率，以期用于结核病及耐多药结核病的快速诊断。

1.材料与方法

1.1 标本来源

722例临床诊断结核病（包括20例NTM感染病例）患者的标本采自2015年12月-2017年1月，临沂市人民医院及兰山区第三人民医院住院及门诊病人。包括痰标本688份，支气管肺泡灌洗液5份，肺外标本29份（包括尿液、胸腹水、胃液、脓液、脑脊液等）。各种标本的留取方法参见《结核病实验室检验规程》[2]。

1.2 患者的诊断

通过回顾查阅患者的病案资料，722例（包括20例NTM感染病例）都符合2002年卫生部制定的临床诊断标准《临床诊疗指南结核病分册》，临床表现有长期低热、盗汗、反复咳嗽、咳痰、消瘦、食欲不振、精神乏力等，经抗结核治疗有效。

1.3 方法

1.3.1 标本前处理 前处理采用碱处理法，标本转移至离心管，根据标本性状加入1～2倍量NALC-NAOH，震荡至均匀的状态，然后静置消化15分钟，用GENEXPERT TB/RIF的专用吸管吸取2ml加入CARTRIDGE反应盒内，尽快放入GENEXPERT TB/RIF反应仪启动反应，剩余的离心管里加入已经灭菌的PH 6.8的PBS缓冲液至45ml处，颠倒混匀，放入低温离心机（8℃）以3000转/分，离心15分钟，取出，弃去上清液，于沉淀中加入1ml左右PBS液，震荡混匀，静置15分钟，期间给罗氏培养管，玻片编号，然后轻轻打开标本处理管，吸取约0.3ml接种3支罗氏培养管，其中1支放29℃培养，2支放36℃培养，培养阳性的菌株接种传统比例法药敏培养基。然后吸取约0.05ml涂抹于载玻片，制成1×2cm面积的薄膜，进行荧光染色后镜检；涂片或者GENEXPERT TB/RIF任一阳性标本吸取0.005ml加入线性探针DNA提取管，用于GenoType MTBDRplu的实验，扩增程序用标本扩增程序。

1.3.2 结核菌检测 痰涂片荧光染色，罗氏培养法，传统比例法药敏实验、XPERT MTB/RIF、GenoTypeMTBDRplu检测步骤皆参照《结核病实验室检验规程》进行。

1.3.3 实验结果的判定与报告 若涂片阳性，GENEXPERT TB/RIF阴性，多为NTM感染，报抗酸杆菌阳性，备注：可能为NTM；若涂片阳性，GENEXPERT TB/RIF阳性，报MTB阳性，RIF resistance检出，报利福平耐药（R），RIF resistance未检出，则报利福平敏感（S），RIF resistance不确定，则报利福平耐药结果无法判读；若涂片阴性，GENEXPERT TB/RIF阳性，报告MTB阳性，报告方式同上；GenoType MTBDRplu实验中，若结核分枝杆菌复合群鉴定条带(TUB带)阴性，表示所试细菌不属于结核分枝杆菌复合群，不能用本实验系统判读药敏结果，报告NTM，无药敏结果；若TUB阳性，则按实验要求分别判断对利福平和异烟肼的耐药情况并给出报告。

1.3.4 耐多药结核病的快速诊断 若GenoTypeMTBDRplu实验异烟肼耐药，GENEXPERT TB/RIF或GenoType MTBDRplu任一实验利福平耐药，则判为MDR患者。

2.结果

见表1、表2、表3。

表1 GENEXPERT TB/RIF与传统改良罗氏培养法结果比较

722 份患者标本，286份罗氏法培养阳性，后经比例法药敏实验鉴定，其中结核分枝杆菌265例，牛分枝杆菌1例，另外还有20例为NTM，阳性率为39.6%，272份快速法诊断阳性，阳性率为37.7%，以临床诊断为金标准，二者阳性率比较差异无统计学意义（χ2=0.572，P＞0.05）。以罗氏培养结果为金标准，快速法的敏感度 为95.1%，特异度为99.8%，符合率为95%。在检测时间方面快速法当日即可报告结果，而培养需要3～8周才能报告结果。

表2 GENEXPERT TB/RIF与比例法药敏检测结核菌（除去NTM）利福平耐药比较

表3 GENOTYPE MTBDRPLUS 检测结核菌（除去NTM）异烟肼、利福平耐药与比例法比较

以比例法药敏实验为金标准，GENEXPERT TB/RIF 检出对利福平耐药的敏感度为78.8%，特异度为99.6%；GenoType MTBDRplu法检出对利福平的敏感度为75.8%，特异度为99.5%，对异烟肼的敏感度为80%，特异度99.1%。MDR检出率为73.1%，48h内即可对结核病及耐多药结核病作出实验室诊断报告。相比比例法药敏要等7～8周，联合检测技术显示了较大的时间优势。

3.讨论

WHO2014年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》对药敏试验有所更新，指出药敏试验包括了表型药敏试验（即传统药敏试验）和基因型药敏试验。笔者认真思考和总结了表型药敏试验和基因型药敏试验的区别，表型药敏试验对耐药的定义为：耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药[3]，换句话说，100条结核菌里有1条以上耐药，即对该药耐药，我们做药敏试验磨菌时取的菌量较多，取到那1%的几率要大，而我们的目的菌就是这1%。在基因型药敏试验中，检测的基因突变是对所取标本中所含有的多数菌的DNA扩增产物的分析，而那1%所占比例太小，以至于不能检出，或者就干脆没有取到那1%，它所代表的是较多数细菌的基因突变情况。所以，本实验也印证了表型药敏试验对MDR的检出率比基因型药敏试验要高的道理。李强等[4]的研究也发现了这一现象。

本研究采用的参照体系罗氏培养法分枝杆菌培养、及比例法药敏试验，在快速诊断方面采用离心浓缩涂片荧光染色＋XPERT MTB/RIF+GenoType MTBDRplu的联合检测，通过形态学和分子生物学技术对结核分枝杆菌进行鉴别，显著提高了结核病和耐药结核病人的检出率，解决了涂片荧光染色只能检出抗酸杆菌，无法区分结核或非结核分枝杆菌的问题，XPERT MTB/RIF的检测靶标为DNA，能检出涂片阴性的MTB，把NTM给排除掉，而且能够比较精确地反映菌量的多少，与GenoType MTBDRplu结合检测是否对利福平、异烟肼耐药，各种方法之间优势互补，互相印证，有效避免了假阳性和假阴性的出现，以及标本中非结核分枝杆菌对结果的干扰，满足临床对结核病和耐多药结核病快速诊断的需求。但相对于传统药敏方法，线性探针GenoType MTBDRplu试剂盒成本较高，对实验室环境及技术人员要求也高，很多基层单位无力承担建设基因实验室的费用，广泛推广难度大，是它的不足之处。

[1]卫生计生部结核病控制中心官网.

[2]赵雁林,逄宇.结核病实验室检验规程，人民卫生出版社,2015年6月,P:5-10.

[3]赵雁林，逄宇.结核病实验室检验规程，人民卫生出版社,2015年6月,P:62.

[4]Li Qiang,Dong Haiyan,Pang Yu,etal,Multicenter Evaluation of the Molecular Line Probe Assay for Multidrug Resistant Mycobacterium Tuberculosis Detection in China[J].Biomed Environ,2015,28(6):464-467.