ALS相关突变型σ1R的激活促进大鼠施旺细胞RSC96的凋亡

周 梅，李增民，郑煜芳,2,3

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438； 2.复旦大学 发育生物学研究院, 上海 200433；3.复旦大学附属妇产科医院 生殖发育研究院，200090)

ALS相关突变型σ1R的激活促进大鼠施旺细胞RSC96的凋亡

周 梅1，李增民1，郑煜芳1,2,3

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438； 2.复旦大学 发育生物学研究院, 上海 200433；3.复旦大学附属妇产科医院 生殖发育研究院，200090)

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种渐进的致命的神经退行性疾病，症状为运动神经元损失所导致的肌肉萎缩和痉挛，大部分病人最后死于呼吸衰竭．对其致病机理的研究主要集中于对神经元的影响，而对施旺细胞在其中的作用至今仍未有报道．之前研究发现在一个青少年发病的ALS家族中，SIGMAR1基因编码区的一个碱基存在错位突变，该突变使Sigma-1型受体(σ1R)的102位氨基酸由谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)．本文通过在大鼠施旺细胞系(RSC96细胞)中过表达野生型及突变型σ1R来研究该突变对RSC96细胞凋亡的影响．实验结果表明在毒胡萝卜素(Thapsigargin)诱导的内质网压力和σ1R激动剂PRE084的刺激下，突变型σ1R使施旺细胞更倾向于凋亡，失去了对胞质Ca2+调节的能力，并且对ADAM10具有更强的抑制作用．本研究提示σ1R突变也可能通过施旺细胞对ALS的病理过程起到作用．

肌萎缩性侧索硬化症； Sigma-1型受体； RSC96； 细胞凋亡； 胞质 Ca2+； 去整合素金属蛋白酶10

肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)是一种渐进性神经退行性疾病．该疾病影响脑干和脊髓的下运动神经元(lower motor neurons)和运动皮层的上运动神经元(upper motor neurons)．该疾病的发病率为 1/105～2/105，其中90～95%为散发性ALS(Sporadic ALS, SALS)，5%～10% 为家族性ALS(Familial ALS, FALS)[1]．在FALS病例中，有10%是由于Cu/Zn超氧化物歧化酶编码基因SOD1的突变而引起的，4%是由于编码TDP-43蛋白的基因TARDBP突变所引起的，此外ANG，VAPB，FUS等基因的突变也都与该疾病有关联[2].2011年Amr Al-Saif等对一个青少年发病的ALS家族进行基因检测研究，发现SIGMAR1的编码区的1个碱基存在错位突变与该家族ALS疾病相关．该突变使Sigma-1受体(σ1R)蛋白的102位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺(σ1RE102Q)，该位点是跨膜区域的高度保守氨基酸，也位于配体结合关键区[3]．研究表明σ1RE102Q在运动神经元细胞系NSC34及成神经细胞瘤Neuro2A细胞中表现出异常的亚细胞分布，并且过表达σ1RE102Q很可能通过引起线粒体功能紊乱而促进内质网压力诱导的细胞凋亡[1,3-4]．

σ1R在中枢神经系统中有较高的表达量，主要位于线粒体相关内质网膜(Mitochondria-Associated endoplasmic reticulum Membrane, MAM)．其主要功能之一是调控细胞质，内质网和线粒体的Ca2+浓度平衡，并且参与细胞凋亡的调控[5]．除此之外，σ1R还对细胞质膜上的蛋白有一定的调控作用．我们前期研究表明过表达σ1R可以抑制细胞质膜上的金属蛋白酶ADAM10的活性[6]．ADAM10通过参与细胞表面多种蛋白的剪切，而起着广泛的作用．例如在BV-2小胶质细胞中，ADAM10参与了与ALS相关的突变型SOD1(G93A)过表达所引起的TNF-α分泌增加，提示ADAM10可能参与ALS进程中的神经炎症反应[7]．ADAM10在施旺细胞中也有较高的表达量，并且是髓鞘化的先决条件，抑制ADAM10的活性显著降低了轴突的长度[8]．最近一篇文章报道ADAM10在受损的神经末端轴突的生长和髓鞘化中起着重要作用[9]．

近几年来，关于ALS的致病机制，一种新的“上行性退化”(“dying back”)理论获得了越来越多的关注．具体说就是ALS被认为是一种远端轴突病变的疾病，发病的最初原因是远端的神经肌肉接头(NMJ, neuromuscular junction)发生了去神经化，进而引起神经元胞体的退化及死亡[10-11]．一些在ALS的动物模型及ALS病人的研究中的发现为该理论提供有力的支持．Frey等人发现神经肌肉接头处的突触对去神经化有不同的抵抗能力，抵抗能力弱的突触在ALS疾病的早期阶段就发生退化[12]．Fischer及其同事发现在G93A-hSOD1ALS的小鼠模型中一部分抵抗能力最弱的神经肌肉突触在神经元胞体死亡之前就开始发生去神经化，并且在一位意外死亡的sALS病人中发现在肌肉处发生去神经化，而神经元胞体并未发生病变[13]．

神经肌肉接头的去神经化不仅涉及神经细胞本身，还涉及到包裹神经轴突末端的胶质细胞—施旺细胞，也被称为末端施旺细胞(Terminal Schwann Cell)．研究发现末端施旺细胞在神经肌肉连接处的轴突芽生及再神经化过程中起着重要的作用，在神经肌肉接头处选择性的消除末端施旺细胞会引起运动神经元末端轴突的回缩[14-16]．

根据上述研究，我们推测σ1R可能不仅仅影响了外周运动神经元本身，还影响了包裹的施旺细胞，所以本工作主要研究了过表达野生型σ1R(σ1RWT)突变型σ1R(σ1RE102Q)对大鼠施旺细胞(RSC96细胞系)的凋亡的影响．同时，施旺细胞对胞内Ca2+浓度变化非常敏感，且通过胞内IP3(inositol 1,4,5-trisphosphate)来控制Ca2+从内质网的释放[11]．由于σ1R主要通过与IP3相互作用来调控细胞Ca2+浓度，并且其与IP3相互作用的异常在细胞凋亡过程中也起着重要的作用[4]，因此我们还进一步研究了该突变对RSC96细胞的Ca2+浓度调控及ADAM10活性的影响．

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞系与质粒

大肠杆菌EscherichiacoliDH5α购于碧云天生物技术研究所．RSC96细胞株购于上海中科院细胞库．pAPtag5质粒来自Carl P. Blobel博士实验室，pAPtag5-Btc质粒由本实验室构建．pcDNA3.0-Flag-hσ1R质粒由复旦大学生理学与生物物理学系梅岩艾教授实验室馈赠．pcDNA3.0-Flag-E102Q-hσ1R、pcDNA3.0-Flag-hσ1R-IRES-mCherry以及pcDNA3.0-Flag-E102Q-hσ1R-IRES-mCherry质粒由本实验室构建．

1.2 pcDNA3.0-Flag-E102Q-σ1R表达质粒的构建

pcDNA3.0-Flag-E102Q-σ1R表达质粒是由pcDNA3.0-Flag-WT-σ1R表达质粒通过点突变构建而成(图1)．我们通过3片段连接，通过引物(表1)引入点突变来构建Flag-E102Q-σ1R表达质粒，用引物E102Q-1F和E102Q-1R通过PCR，得到含有E102Q突变的片段1；用引物E102Q-2F和E102Q-2R通过PCR，得到片段2．之后，用HindⅢ酶切处理片段1，用EcoR I酶切处理片段2，同时用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切

图1 pcDNA3.0-Flag-E102Q-σ1R 表达质粒的构建Fig.1 The construction of pcDNA3.0-Flag-E102Q-σ1R plasmid

引物序列酶切位点E102Q-1F5’-CCAAGCTTACCATGGGAG-3’HindⅢE102Q-1R5’-CAGCACATACTGGGACAG-3’E102Q-2F5’-CTCTTCGGCACCGCCTT-3’E102Q-2R5’-CAGAATTCAAGGGTCCTGG-3’EcoRⅠ

注： 引物E102Q-1R中标出的G为点突变位点．

pcDNA3载体，切胶回收酶切后的3个片段，用T4DNA连接酶进行连接，之后转化E.coliDH5α感受态，挑克隆，通过酶切鉴定得到正确连接的质粒．测序验证并转染细胞检验质粒能否正常表达σ1R．

1.3 pCAG-flag-WT/E102Q-σ1R-IRES-mCherry表达质粒的构建

为了在RSC96中表达WT/E102Q-σ1R，我们构建了pCAG-flag-WT/E102Q-σ1R-IRES-mCherry表达质粒．首先，通过PCR从mCherry表达质粒上克隆出带有XbaI和NotI酶切位点的mCherry片段，之后用XbaI和NotI限制性内切酶双酶切mCherry片段和pIRES载体，回收后进行双片段连接，转化E.coliDH5α感受态，然后涂板，挑克隆，最后筛选出测序正确的pIRES-mCherry阳性克隆．之后用EcoR I和NotI双酶切上步得到的pIRES-mCherry质粒，从而获得IRES-mCherry片段．用带有EcoR I酶切位点的上下游引物从pcDNA3.0-Flag-WT/E102Q-σ1R表达质粒上克隆出两端带有EcoR I酶切位点的Flag-WT/E102Q-σ1R片段，并且用EcoR I单酶切该片段．同时，用EcoR I和NotI双酶切pCAG-YFP质粒，部分与IRES-mCherry片段进行双片段连接，部分与带有EcoR I限制性内切酶粘性末端的Flag-WT/E102Q-σ1R片段及IRES-mCherry片段进行3片段连接，经过转化，筛选，最终获得pCAG-mCherry质粒和pCAG-flag-WT/E102Q-σ1R-IRES-mCherry质粒．

表2 mCherry及Flag-WT/E102Q-σ1R引物序列Tab.2 PCR primers for mCherry and Flag-WT/E102Q-σ1R

1.4 细胞培养与转染

实验中RSC96细胞使用含10%胎牛血清(购于四季青公司)及1%青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基(购于GIBCO公司)，并置于条件为37℃、5% CO2的培养箱中进行培养．将RSC96细胞培养后接种至六孔板或者是35mm小皿内，细胞密度为70%时开始转染．培养的细胞去培养基，用PBS洗一遍，加入1mL DMEM，之后将准备好的转染复合物(Lipo2000∶质粒=4μL∶1μg)小心加入培养的细胞中，小心混匀，将细胞放回培养箱中培养5h后，换成含10% FBS的DMEM继续培养19～44h后，收集上清或细胞做下一步实验．

1.5 细胞凋亡实验

将细胞接种到24孔板，待细胞密度达到70%左右转染．转染24h后，吸掉培养液，用PBS洗一遍，每孔加入500μL含有9μmol/L毒胡萝卜素(Thapsigargin，TG)或者含有9μmol/L TG及PRE084的DMEM．孵育24h之后，用100μL 0.05%胰酶消化细胞，之后加培养液中和胰酶．收集细胞到1.5mL离心管中，1000g离心3min，再用PBS洗两遍，最后每管细胞用110μL染料溶液(5μL PI+5μL Annexin V+100μL 1×Binding Buffer)重悬，避光孵育15min．每孔加入400μL 1× Binding Buffer，吹吸，使细胞混匀，用滤网过滤除去细胞团块，之后加入流式细胞仪专用管中，进行检测．

1.6 胞质Ca2+实时监测

将细胞接种到35mm小皿中．转染20h后，加入DMSO或PRE084，孵育24h之后，用0.05%胰酶消化细胞．然后取1/4细胞接种到35mm玻璃底细胞培养皿中，使其均匀分散．待细胞完全贴壁后，吸掉细胞液，用PBS洗一遍，每孔加入1mL含有5μmol/L Fura-2/AM(购于Life Technologies公司)和0.02% Pluronic F-127(质量浓度)的Opti-MEM，37℃，避光孵育30min．吸掉孵育液，用1×HEPES buffer洗3次，之后每孔加入1mL HEPES buffer．将待检样品放在显微镜载物台上观察，找到有表达mCherry的细胞(即过表达WT/E102Q-hσ1R)，之后通过钙离子检测系统(CCD相机+尼康倒置显微镜+MetaFluor软件系统)实时监测测定340nm和380nm激发的荧光值及其比值．在开始记录1min后，加入Ionomycin，使其终浓度为2.5μmol/L，继续记录，总记录时间为5min．

1.7 AP酶联显色反应

细胞接种至六孔板中，待细胞密度达到70%左右进行转染，pAPtag5-BTC与pcDNA3.0、pcDNA3.0-Flag-hσ1R、pcDNA3.0-Flag-E102Q-hσ1R、pCAG-IRES-mCherry、pCAG-Flag-hσ1R-IRES-mCherry或pCAG-Flag-E102Q-hσ1R-IRESmCherry共转．转染24h后，用PBS清洗．每孔细胞加入1mL Opti-MEM，孵育1h，收集上清，作为对照组(Control)；再加入1mL含2.5μmol/L Ionomycin(IM)的Opti-MEM孵育1h．若进行PRE084刺激，则在第2个小时里先加入1mL含50μmol/L PRE084的Opti-MEM孵育15min；然后补充加入IM，IM和PRE084共孵育45min，收集上清．将收集的上清于12000g离心10min，吸取100μL上清，加入100μL反应底物(2mg/mL 4-NPP(购于AMRESCO公司)，100mmol/L Tris-HCl(pH 9.5)，100mmol/L NaCl，20mmol/L MgCl2)，混匀后加入到96孔板内，于37℃进行反应，之后用酶标仪检测405nm处的吸光值．各组ADAM10的活性值=刺激1h的AP值/对照1h的AP值．

1.8 统计学方法

2 结果与分析

2.1 过表达σ1RWT或σ1RE102Q对RSC96凋亡的影响

研究表明过表达σ1RWT可以抑制内质网压力诱导的凋亡[4]．毒胡萝卜素是内质网Ca2+-ATP酶选择性抑制剂，可以不可逆地使内质网钙池排空，使胞质内Ca2+浓度持续升高，从而诱导细胞发生内质网应激反应并最终发生凋亡[17]．因此我们就选用TG作为凋亡药物来诱导RSC96细胞的凋亡，然后用PI和Annexin V双染色法结合流式细胞仪进行检测．我们用处于早期凋亡状态(Annexin V+/PI-)及晚期凋亡状态(Annexin V+/PI+)细胞所占的比例来代表细胞的凋亡程度(图2(b)中Q2+Q3)．结果显示9μmol/L TG处理24h可以显著诱导RSC96细胞的凋亡(图2)．然而过表达σ1RWT或σ1RE102Q均对TG诱导的凋亡没有影响(图2)．

图2 毒胡萝卜素可诱导RSC96细胞的凋亡Fig.2 Thapsigargin induced apoptosis of RSC96 cells(a)显示的是圈选的细胞；(b)和(c)为转染了pCAG后，分别DMSO组和TG组处理的Annexin V和PI信号示意图，Q1是死亡的细胞的比例，Q2是晚期凋亡细胞的比例，Q3是早期凋亡细胞的比例，Q4是正常细胞的比例；细胞凋亡比例为(Q2+Q3)/(Q1+Q2+Q3+Q4)．(d)为9μmol/L TG处理24h对RSC96细胞凋亡影响统计图．各组细胞分别用DMSO处理时的细胞凋亡比例为基础值进行标准化，误差为±S.E.M，n=4，**P<0.01，***P<0.001．

2.2 σ1R激动剂PRE084对RSC96细胞凋亡的影响

在体内，σ1R的作用受其激动剂及抑制剂的调控[18-22]，而σ1RE102Q突变位点位于配体结合关键区，所以我们检测了σ1R的激动剂PRE084作用下，E102Q突变是否会影响σ1R的功能．令人惊讶的是PRE84显著增强了TG所诱导的RSC96细胞的凋亡(图3(a))．过表达σ1RWT对TG+PRE84刺激诱导的RSC96细胞的凋亡没有影响，而过表达σ1RE102Q增强了TG+PRE84刺激诱导的RSC96细胞的凋亡(图3(b))．

图3 PRE084可以显著增强毒胡萝卜素所诱导的RSC96细胞的凋亡Fig.3 PRE084 significantly increased TG-induced apoptosis of RSC96 cells(a)为PRE084对TG诱导的RSC96凋亡的影响，n=4，**P<0.01；(b)为PRE084对过表达WT-σ1R或E102Q-σ1R细胞TG诱导凋亡的促进作用，各组为(TG+PRE084)/TG诱导的凋亡比例．误差为±S.E.M，n=4，*P<0.05．

2.3 σ1R及PRE084对细胞质Ca2+浓度的影响

σ1R的主要功能之一是平衡细胞质的Ca2+的浓度，而Ca2+浓度的调控不仅影响细胞的凋亡，并且也影响着施旺细胞对轴突释放的神经递质的响应．为了研究过表达σ1RWT或σ1RE102Q对细胞质Ca2+浓度的影响，我们使用Ionomycin诱导RSC96细胞细胞质Ca2+浓度的迅速上升[23-25]，通过实时检测胞质Ca2+浓度的变化发现过表达σ1RWT可以显著抑制Ionomycin诱导的RSC96细胞胞质Ca2+浓度的上升(图4)，而过表达σ1RE102Q对Ionomycin诱导的RSC96细胞胞质Ca2+浓度的上升没有显著影响(图4)．这说明E102Q突变使σ1R丧失了对胞质Ca2+浓度的调控作用．PRE084的刺激显著促进了Ionomycin诱导的细胞质Ca2+浓度的上升(图4)．该结果暗示PRE084可能是通过促进细胞质Ca2+浓度的上升来促进内质网

图4 过表达σ1RWT或σ1RE102Q及PRE084对Ionomycin引起的细胞质Ca2+浓度上升的影响Fig.4 The effects of overexpression of σ1RWT or σ1RE102Q and PRE084 on Ionomycin-induced up-regulation of cytoplasmic [Ca2+] in RSC96 cells(a)，(b)，(c) 图依次为pCAG组，过表达σ1RWT组和过表达σ1RE102Q组的Ca2+浓度变化时间曲线，对照组的一个代表性细胞的细胞质Ca2+浓度随时间的变化以及PRE084组的一个代表性细胞的细胞质Ca2+浓度随时间的变化；(d) 为Ionomycin刺激后的峰值与基准值之比的统计图．其中误差为±S.E.M，n=6，每次细胞数平均大于10，*P<0.05，****P<0.0001．

压力下RSC96细胞的凋亡．然而过表达σ1RWT或σ1RE102Q均不影响PRE084对胞质Ca2+浓度上调的促进作用，说明在胞质Ca2+浓度调控方面，E102Q突变对PRE084的作用并没有影响．

2.4 过表达σ1RWT或σ1RE102Q及PRE084对ADAM10活性的影响

ADAM(A Disintegrin And Metalloprotease)家族的成员是一类锚定在膜上的金属蛋白酶，在蛋白胞外域的剪切过程中起着重要作用[26]．ADAM10的活性主要受到胞质Ca2+浓度的调控；此外ADAM10在施旺细胞中有较高的表达量，被发现是髓鞘化的一个先决条件，在轴突生长中起着重要作用，并且在轴突受损后，在末端轴突的髓鞘化和生长中起着重要作用[8-9]，所以接下来下来我们检测了过表达σ1RWT或σ1RE102Q对ADAM10活性的影响，并且检测了PRE084对ADAM10活性的影响．在ADAMs的众多底物中，β-细胞素(betacellulin, BTC)是ADAM10专属底物[27]．为了检测ADAM10的活性，我们在细胞中过表达定量的胞外域末端带有碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP)标签的BTC，ADAM10活性越强，切割释放到细胞培养液中带AP标记的成熟BTC的含量就越多，然后通过AP酶联显色实验来检测细胞培养液中BTC-AP的活性，并以此代表ADAM10的活性[6]．Ionomycin(IM)是已知的ADAM10激活剂[6,27]，结果表明过表达σ1RWT对IM促进的ADAM10活性有显著抑制作用，这与我们之前的研究相一致[6]，而过表达σ1RE102Q对ADAM10活性有更强的抑制作用(图5(a))．有意思的是，在PRE084的共同作用下，IM促进的ADAM10活性受到PRE084的抑制(图5(b))，而过表达σ1RWT对PRE084产生的抑制效应有抵消，而过表达σ1RE102Q的情况下，PRE084对ADAM10活性的抑制作用依然存在(图5(c))．

图5 过表达σ1RWT或σ1RE102Q及PRE084对ADAM10活性的影响Fig.5 The effects of overexpression of σ1RWT or σ1RE102Q and PRE084 on ADAM10 activityRSC96细胞转染AP-BTC或相应σ1R表达质粒，24h后进行AP活性实验．第1h用对照(Control)的DMEM，第2h则加入相应的刺激剂(IM或IM+PRE084)，收集上清进行AP实验．各组的活性值=刺激1h的AP值/对照1h的AP值．(a)显示IM激活ADAM10活性可以被过表达的σ1R抑制，且过表达σ1RE102Q比过表达σ1RWT具有更强的抑制作用．(b)在对比转染了pCAG和AP-BTC质粒的细胞中IM和IM+PRE084刺激下ADAM10活性；PRE084+IM组加入了含有PRE084(终浓度50μmol/L)和IM的DMEM．结果显示PRE084显著抑制AMDA10的活性．(c)显示在过表达σ1RWT或σ1RE102Q的情况下，PRE084对ADAM10活性的抑制作用．过表达σ1RWT可以抵消PRE084的抑制作用，而σ1RE102Q不能抵消．误差为±S.E.M，n=6，*P<0.05，**P<0.01．

3 讨 论

本研究利用了大鼠施旺细胞系RSC96研究了σ1R的E102Q突变对其凋亡和细胞内Ca2+浓度以及ADAM10活性的影响．首先，本研究发现虽然过表达σ1RWT或者σ1RE102Q对TG诱导RSC96细胞的凋亡没有影响，但是在激动剂PRE084存在的情况下，过表达σ1RE102Q促进了TG诱导的RSC96细胞的凋亡．从该结果可以看出，无论在正常生理状态，还是在内质网压力情况下，E102Q突变都不影响σ1R对细胞凋亡的影响，然而当σ1R受到激动剂激活后，E102Q突变使处于内质网压力下的RSC96细胞更易于凋亡．相对于原代培养的施旺细胞，RSC96细胞系易于培养与操作，能缩短实验周期和降低实验成本．后续如果能够采用含有此突变的ALS病人来源的施旺细胞或者iPSC诱导分化的胶质细胞，将能进一步模拟和深入了解病人体内的机制．由于施旺细胞是构成周围神经系统髓鞘的主要细胞，并且在神经肌肉接头处突触的维持中起着重要作用，髓鞘细胞的凋亡不仅影响周围神经系统的髓鞘的维持，从而影响动作电位的传递，并且也会影响NMJ的维持，从而使周围神经系统更容易发生去神经化，而NMJ处的去神经化是早期ALS的病症之一，并且影响着ALS疾病的进程[14-16,28]．由此，我们推测E102Q可能通过促进应激条件下施旺细胞的凋亡而使NMJ处更容易发生运动神经元末端轴突的回缩而影响ALS疾病的发病及进程．

其次，本研究发现σ1RE102Q丧失了对胞质Ca2+浓度的调控能力——当胞质Ca2+浓度在Ionomycin刺激下迅速上升时，过表达σ1RWT抑制了胞质Ca2+浓度上升的幅度，而过表达σ1RE102Q却无法抑制胞质Ca2+浓度的上升幅度．之前研究指出σ1RE102Q在运动神经元细胞系中表现出异常的亚细胞分布状态，由正常的主要位于线粒体相关的内质网膜(MAM)变为主要分布于细胞质中[1,3]．σ1R在激动剂刺激下，会与MAM处的IP3解离而转移到细胞质[5]．而在本研究中也发现σ1R的激动剂PRE084会促进胞质Ca2+浓度上升的幅度．由此可以推测E102Q突变使σ1R处于一定程度的被激活状态，而这种状态在一定程度上影响了其对胞质Ca2+浓度的调控能力．对胞质Ca2+浓度不仅在细胞凋亡中起着重要调控作用，而且也影响着施旺细胞对周围环境刺激的相应[5,11]，因此，E102Q突变可能通过影响施旺细胞Ca2+信号而影响了其对NMJ突触的调控，

然后，本研究发现过表达σ1RE102Q或σ1RWT对ADAM10活性都有显著抑制作用，并且σ1RE102Q对ADAM10活性的抑制作用更强．据报道，ADAM10在受损的末端轴突生长中起着重要作用，并且是髓鞘化过程的先决条件[8-9]，而σ1RE102Q对ADAM10活性的抑制可能会影响NMJ处轴突的生长及髓鞘化而使NMJ更容易发生去神经化．

据此，我们推测SIGMAR1基因的E102Q突变影响了ALS病人的施旺细胞对NMJ的维持，调控及受损后的修复，从而协助推进了早发性ALS疾病的进展．然而该推测还有待体内及体外实验的进一步研究验证．

虽然大部分文献报道σ1R的激动剂对细胞都是起到保护作用的，但是主要是针对神经元的研究[19-20,29-30]．在RSC96细胞中，PRE084的刺激加剧了Ionomycin诱导的胞质Ca2+浓度的上升，具有抑制ADAM10活性的作用，并且显著地增强了TG诱导的细胞凋亡．这说明σ1R的激动剂在神经元及施旺细胞中具有不同的作用，仅盲目地通过激活σ1R以抑制神经元凋亡并不一定可以延缓ALS的病情．这也暗示对ALS致病机制及疾病进程的研究需要综合考虑各个因素的影响．

此外，之前研究结果显示ADAM10活性受胞质Ca2+浓度的调控，而在本研究中，虽然过表达σ1RE102Q对Ionomycin诱导的胞质Ca2+浓度的上升没有影响，而PRE084刺激可以促进Ionomycin诱导的胞质Ca2+浓度的上升，但是过表达σ1RE102Q和PRE084刺激却都对ADAM10的活性具有显著地抑制作用，说明σ1RE102Q及PRE084并不通过调控胞质Ca2+浓度来调控ADAM10的活性．对于具体的调控机制，还有待进一步研究．

总之，本文初步地研究了与ALS相关联的σ1R的E102Q突变对大鼠施旺细胞RSC96细胞的影响，表明σ1R突变可能通过施旺细胞在ALS疾病的致病机制中发挥着一定作用．

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Activationofσ1RMutationRelatedtoALSPromotestheApoptosisofRatSchwannCellsRSC96

ZHOUMei1,LIZengmin1,ZHENGYufang1,2,3

(1.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China；2.InstituteofDevelopmentalBiologyandMolecularMedicine,FudanUniversity,Shanghai200433,China；3.InstituteofReproductiveandDevelopmentalResearch,ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity,Shanghai200090,China)

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease characterized by loss of upper and lower motor neurons in the brain and spinal cord, leading to amyotrophy and spasm and ultimately death from respiratory failure. Most studies focused on motor neurons to understand the pathogenesis of this disease, while none have tried to explore the role of Schwann cells in the progression of ALS. Previous study reported a mutation ofSIGMAR1 gene in a family of juvenile ALS. The 102ndamino acid of mutated sigma-1 Receptor (σ1R) turned to be glutamine (Q) instead of glutamic acid (E). We overexpressed wild-type or mutated σ1R in rat Schwann cells (RSC96 cell line) to explore the effects of this mutation on apoptosis of RSC96 cells. Our results showed that under Thapsigargin-induced ER stress and stimulation of PRE084 (agonist of σ1R), overexpression of mutated σ1R promoted apoptosis in RSC96 cells, lost the ability to inhibit the upregulation of cytoplasmic Ca2+, and exerted stronger inhibition ofADAM10activity. Our study suggested a possible role of Schwann cells in the pathogenesis of ALS through mutated σ1R.

ALS; σ1R; RSC96; cell apoptosis; cytoplasmic Ca2+; ADAM10

0427-7104(2017)06-0662-09

2017-02-21

国家重点基础研究发展计划(2013CB945404),上海市科委重点创新项目(14JC1401000)

周 梅(1987—)，女，硕士研究生；郑煜芳，女，副教授，通信联系人，E-mail： zhengyf@fudan.edu.cn.

Q25

A