异紫堇碱抑制裸鼠人宫颈癌Siha细胞移植瘤的生长

梁仲珍，曾 婧，陈 莉，刘 斌，王 芳*

(1.兰州大学第二医院 妇产科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学 甘肃 兰州 730000；3.中国人民解放军兰州军区兰州总医院 病理科，甘肃 兰州 730000)

研究论文

异紫堇碱抑制裸鼠人宫颈癌Siha细胞移植瘤的生长

梁仲珍1，曾 婧2，陈 莉1，刘 斌3，王 芳1*

(1.兰州大学第二医院 妇产科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学 甘肃 兰州 730000；3.中国人民解放军兰州军区兰州总医院 病理科，甘肃 兰州 730000)

目的研究异紫堇碱(ICD)对裸鼠人宫颈癌Siha细胞移植瘤的影响，探讨异紫堇碱抑制宫颈癌发生发展的机制。方法将人宫颈癌Siha细胞接种于BALB/c(nu/nu)裸鼠皮下建立动物模型，待移植瘤平均直径≥0.5 cm时，随机分为对照组及腹腔注射不同剂量异紫堇碱干预组。4周后取出瘤体组织，用HE染色法观察瘤体组织病理形态学，用免疫组化染色及Western blot方法观察负荷瘤组织中的蛋白表达。结果经异紫堇碱干预后的宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤体积减小(P<0.05)；细胞形态可由干细胞样向上皮样细胞转化；上皮细胞分化成熟标记E-cadherin表达明显升高，而HPV16E6蛋白和间叶组织标志物vimentin的表达下降。结论异紫堇碱可能通过抑制携带HPV亚型的宫颈癌Siha细胞中E6蛋白的表达及EMT相关信号通路来抑制宫颈癌的发生发展。

异紫堇碱；Siha细胞；皮下移植瘤；蛋白表达

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，也是导致全世界妇女死亡的主要恶性肿瘤之一。2012年GLOBOCAN(全球癌统计组织)调查显示全球每年有近53万宫颈癌新发病例，近27万例死于该疾病，主要发生在发展中国家。中国每年约有13.2万新发病例，发病率为15.7/10万，病死率为8.3/10万，严重危害女性健康[1- 2]。持续高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宫颈癌发生的必要条件和根本因素。生殖系统人乳头瘤病毒有200多种亚型，其中高危型的有HPV16、18、31、33、52和58等。E6和E7蛋白是高危型HPV的主要癌蛋白，E6和E7蛋白分别与细胞周期调节蛋白p53和RB结合，导致细胞失去周期阻滞及凋亡功能，不受机体的控制，呈恶性增殖[3]。前期研究发现，异紫堇碱(isocorydine, ICD)能够抑制携带不同HPV亚型的人宫颈癌HeLa和Siha细胞系中E6、E7基因和蛋白的表达，并且能够抑制人宫颈癌HeLa、Siha和C33A细胞的增殖，诱导其凋亡。计算机分子对接筛选技术研究发现，异紫堇碱(ICD)可以稳定地结合HPV16E6蛋白[4]，表明HPV16E6很可能是异紫堇碱的作用靶点[5]。已有研究发现，异紫堇碱能够显著降低肝癌细胞系中具有干细胞特征的侧群细胞的比例，增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性，并且对肿瘤干细胞具有较好的靶向性，对其多药耐药具有逆转作用[6- 7]。异紫堇碱的新型衍生物的抗肿瘤活性及稳定性显著增加[8- 10]。目前，异紫堇碱在宫颈癌中的研究较少，因此寻找针对HPV的新型抗肿瘤药物意义重大。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物及试剂：异紫堇碱单体(中国科学院兰州化物所柳军玺等研究员从罂粟科植物秃疮花中提取后制得，纯度大于90%)，并在4 ℃条件下避光保存。E-cadherin抗体和HPV16E6抗体(Santa Cruz公司)；vimentin抗体和GAPDH抗体(CST公司)。

1.1.2 试验动物及细胞：SPF级BALB/c(nu/nu)裸鼠，雌性，4～6周龄，体质量18～20 g(上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物检疫合格证号：3100110324)。饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级实验室。携带HPV16E6的宫颈癌Siha细胞系(中国科学院上海细胞库)，在兰州大学第二医院消化肿瘤重点实验室培养。

1.2 方法

1.2.1 宫颈癌Siha细胞系的培养：用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2，空气湿度为95%的细胞培养箱内培养。用处于对数增殖期的细胞进行传代培养。

1.2.2 宫颈癌Siha细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分组：取处于对数增殖期的Siha细胞，调整细胞为1×107个/mL，注射于裸鼠后背部靠近腋窝处皮下，0.2 mL/只。达成瘤标准(负荷瘤瘤径≥0.5 cm)后，随机分组。PBS组，8只，0.1 mL/d腹腔注射；异紫堇碱高、中和低剂量组，每组7只，0.4、0.2和0.1 mg/(kg·d)腹腔注射；紫杉醇(paclitaxel,TAX)组，7只，12 mg/(kg·d)，连续腹腔注射5 d/周；用药4周后取出瘤体组织。

1.2.3 HE染色：HE染色观察PBS组、紫杉醇组及不同浓度异紫堇碱干预组宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤组织的病理学变化。

1.2.4 免疫组织化学染色观察E-cadherin和vimentin蛋白表达含量：根据阳性细胞在全部癌细胞中所占比例及阳性细胞染色强度判定试验结果，A：按阳性细胞比例评分，每张切片计数5个高倍视野(×400)中阳性细胞数，阳性细胞率=阳性细胞数/总细胞数×100%。阳性细胞数<1/3为1分，阳性细胞数1/3～2/3为2分，阳性细胞数≥2/3为3分；B：按细胞染色强度评分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。积分数=A×B，A×B=0判定为无表达，A×B≤4判定为低表达，A×B>4判定为高表达。

1.2.5 Western blot检测HPV16E6、E-cadherin和vimentin蛋白表达：将各组负荷瘤组织分别研磨，然后加入细胞裂解液提取蛋白样品，取等量蛋白样品，上样、电泳和转膜，封闭后分别加入HPV16E6、E-cadherin和vimentin一抗，4℃孵育过夜，PBST脱色，加二抗，ECL化学发光试剂，X线胶片曝光、定影和显影，最后用凝胶成像仪拍照。结果以目的蛋白/内参照吸光度的比值来表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 裸鼠皮下移植瘤体积

用药4周后，ICD组的瘤体体积小于对照组。高、中和低3个剂量ICD组的瘤体体积分别为(0.15±0.05)cm3，(0.19±0.08)cm3和(0.23±0.07)cm3，显著低于对照组(0.41±0.10)cm3(P<0.05)，也低于TAX组(0.38±0.13)cm3(P<0.05)。

2.2 HE染色结果(图1)

2.3 免疫组化染色结果

ICD组和TAX组宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤组织中E-cadherin的表达高于对照组(P<0.05)，而ICD组vimentin的表达显著低于TAX组和对照组(P<0.05)(图2，表1)。

图1 HE染色：宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤组织细胞形态发生上皮样转化

图2 经异紫堇碱干预后的宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤组织中E-cadherin(A)及vimentin(B)的表达

groupnE-cadherinvimentinlowhighlowhighPBS65124ICD92*7*6*3*TAX60606

*P<0.05 compared with control.

2.4 Western blot实验结果

ICD组和TAX组E-cadherin蛋白的表达高于对照组(P<0.05)，而ICD中剂量组vimentin和HPV16E6蛋白的表达显著低于PBS组和TAX组(P<0.05)(图3，表2)。

3 讨论

宫颈癌是女性常见的肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势，且发病年龄趋于年轻化。目前，临床上早期宫颈癌的治疗主要以手术切除为主，中晚期主要以放化治疗为主，其中化疗以铂类及紫杉醇等药物为主，尚无针对HPV阳性宫颈癌治疗的靶向药物。从具有中国西北特色的传统中草药秃疮花中提取发现的异紫堇碱具有抑制HPV感染及高效抗肿瘤活性[11]，为临床宫颈癌的药物治疗提供了新的思路。已有研究表明，异紫堇碱能够显著降低肝癌细胞系侧群细胞的比例，而肝癌侧群细胞具有干细胞特征，属于高度耐药细胞群，对多种临床化疗药物不敏感，异紫堇碱对肿瘤干细胞CD133具有良好的靶向作用，并对其多药耐药具有逆转作用。异紫堇碱能够通过上调cyclinB1 and p-CDK1表达来诱导G2/M期细胞周期阻滞和凋亡，降低了肝癌细胞系SMMC-7721和 Huh7的致瘤性[6- 7]。研究还发现，异紫堇碱新型衍生物具有抗肿瘤活性及稳定性[8- 10]， 对开发新型抗肿瘤药物意义重大。

图3 经异紫堇碱干预后宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤组织中E-cadherin、vimentin及HPV16E6蛋白的表达

groupHPV16E6/GAPDHE-cadherin/GAPDHvimentin/GAPDHCtr. 0.165±0.011 0.153±0.040 0.588±0.021L 0.116±0.028* 0.194±0.049* 0.444±0.034*M 0.092±0.011* 0.459±0.016* 0.207±0.030*H 0.112±0.003* 0.380±0.035* 0.326±0.021*Tax. 0.158±0.037 0.621±0.110 0.637±0.082

*P<0.05 compared with control.

本研究发现，经异紫堇碱干预后的宫颈癌Siha细胞裸鼠负荷瘤体积减小，说明异紫堇碱可以显著抑制肿瘤的生长，对于在临床上肿瘤期别较晚，瘤体组织较大的患者，可以通过新辅助化疗的方法缩小瘤体体积以获得手术机会，从而达到延长生存期，改善患者生活质量的目的；上皮细胞分化成熟标记E-cadherin表达明显升高，而HPV16E6蛋白和间叶组织标志物vimentin的表达下降，E-cadherin的低表达及vimentin表达的升高是上皮间充质转换(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)发生的重要标志，而EMT是肿瘤发生及转移过程中的重要环节[12]，说明异紫堇碱可能通过抑制携带HPV亚型的宫颈癌Siha细胞中E6蛋白的表达及EMT相关信号通路来抑制宫颈癌的发生发展。

综上所述，异紫堇碱有望被开发成为针对HPV阳性宫颈癌的有效靶向治疗药物，或与临床常用抗肿瘤药物联合来增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

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Isocorydine inhibits the growth of human cervical carcinoma (Siha) cells xenografts in nude mice

LIANG Zhong-zhen1, ZENG Jing2, CHEN Li1, LIU Bin3, WANG Fang1*

(1.Dept. of Gynaecology and Obstetrics, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000; 2.Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 3.Dept. of Pathology, General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveStudy on the effect of isocorydine in human cervical cancer Siha cells xenografts in nude mice, to explore the inhibition mechanism of isocorydine in cervical carcinoma.MethodsEstablishment of human cervical cancer Siha cells subcutaneous xenografts model in BALB/c (nu/nu) nude mice. When the average diameter of the transplanted tumor≥0.5 cm, mice were randomly assigned into control group and experimental group. In experimental group, the model was administered by intraperitoneal injection of different doses of isocorydaline. After 4 weeks, the tumor tissues were removed, the histopathological changes of the tumor were observed by HE staining, and the expression of proteins in the tumor tissue were observed by immunohistochemical staining and Western blot.ResultsCompared with the control group, the tumor volume of experimental group was significantly decreased(P<0.05); the cell morphology transformed from stem cells to epithelioid cells, and the expression of E-cadherin was significantly increased while the expression of HPV16E6 and vimentin was decreased.ConclusionsIsocorydine may inhibit the development of cervical cancer by inhibiting the expression of E6 protein and EMT-related signaling pathway.

isocorydine; Siha cells; xenografts; protein expression

2017- 08- 08

2017- 11- 06

甘肃省科技支撑计划(145RJZA160)

*通信作者(correspondingauthor)：wangfang4323@126.com

1001-6325(2018)01-0069-05

R73- 35+4

A