阿特拉津降解菌MSD6鉴定及其降解特性研究

李文帅 段玉春 范文艳 韩文革 姜述君

摘 要：阿特拉津是一种高效除草剂，但其广泛大量的使用对生态环境和人类健康造成了危害。研究采用富集法从黑龙江省南部长期施用阿特拉津玉米田土壤中分离到一株能降解阿特拉津的菌株MSD6，通过生理生化和16S rRNA序列分析，确定菌株MSD6为节杆菌属（Arthrobacter sp.），该菌株16S rRNA序列GenBank登录号为MH698840。菌株MSD6在48h对阿特拉津的降解率可达到90%以上。菌株MSD6对碱性环境适应性较好，在pH为9的条件下生长OD600值为0.486，对阿特拉津的降解率为30.89%。该菌株也显示出对NaCl胁迫有较好耐性，在4%NaCl胁迫下，其生长量OD600值为0.455，阿特拉津降解率为43.91%。菌株对高温环境适应性相对较差。菌株MSD6生长和降解阿特拉津的适宜pH为6～7，最适温度为30℃。

关键词：阿特拉津；生物降解；节杆菌属

中图分类号 X172；X592 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）20-0045-5

Identification and Characterization of Atrazine-degrading Bacterial Strain MSD6

Li Wenshuai et al

（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：Atrazine is a highly effective herbicide，but its widespread use poses a threat to the ecological environment and human health. An atrazine-degrading strain MSD6 was isolated from the soil of maize fields in southern Heilongjiang Province. The strain MSD6 was identified as Arthrobacter sp by physiological，biochemical and 16S rRNA sequence analysis. The 16S rRNA sequence GenBank login number of the strain was MH698840. The degradation rate of strain MSD6 in atrazine at 48h can reach more than 90%. The strain MSD6 was well adapted to alkaline environment. The growth OD600 value and the degradation rate of atrazine were 0.486 and 30.89% at pH 9，respectively. The strain also showed better tolerance to NaCl stress. Under 4% NaCl stress，its growth OD600 value was 0.455，and the degradation rate of atrazine was 43.91%. The adaptability of strain to high temperature environment is relatively poor. The optimum pH for growth and degradation of atrazine by strain MSD6 was 6～7 and the optimum temperature was 30℃.

Key words：Atrazine；Biodegradation；Arthrobacter sp.

自從化学除草剂问世以来，除草剂的应用对提高作物产量和品质发挥了重要的作用。阿特拉津是除草剂种类中的一个重要品种，是防治玉米杂草的主要除草剂品种之一，目前在玉米种植中被广泛使用。由于阿特拉津除草剂属于长残效除草剂，在土壤中半衰期长，极易对一些后茬敏感作物造成药害[1]。此外，许多研究也证明了阿特拉津不仅污染地下和地表水，同时对生态环境也有较大危害[2]。阿特拉津不仅干扰蛙类的性发育[3]，同时也可诱导乳腺癌和卵巢癌的发生[4]。早在1998年，阿特拉津已被世界野生动物基金会（WWF）列为环境激素类物质[5]。因此，如何有效应对阿特拉津的污染成为广泛关注的焦点。阿特拉津在土壤中的降解可通过化学和生物途径来完成，其中生物降解途径是其降解的主要过程。近年来，已报道的降解阿特拉津的生物主要有细菌、真菌和藻类等。由于气候和生态环境因素对微生物有较大的影响，同一菌株在不同地域环境条件下降解阿特拉津能力常表现出较大的差异[6]。因此，笔者从黑龙江省南部地区长期施用阿特拉津的玉米田中分离、驯化高效降解菌，对菌株的鉴定、其适宜生长环境以及对降解阿特拉津的影响进行了研究，以期为其在阿特拉津污染环境的生物修复应用中提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试土样 研究所用的土样采集自黑龙江省尚志市帽儿山镇长期施用阿特拉津的玉米（Zea mays L.）田，用土钻取0～15cm土样，然后将土样装入封口袋中4℃保存。

1.2 试剂 阿特拉津原药（纯度98%）购自上海源叶生物科技有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯，用于液相色谱的试剂均为色谱纯。

1.3 培养基 LB培养基：10.0g蛋白胨、5.0g酵母粉、10.0gNaCl、1000mL蒸馏水、13.0g琼脂粉。无机盐培养基：0.4gMaCl、0.2gMgSO4.7H2O、1.5gNaH2PO4、1.5gKH2PO4、1mL微量元素营养液、1000mL蒸馏水、pH7.0。微量元素配方：0.4gNa2B4O7·10H2O、0.5gNa2MoO4·2H2O、0.8gCuSO4·5H2O、2gFeSO4·7H2O、2gMnSO4·H2O、10gZnSO4·7H2O、5g EDTA）。根据实验要求加入适量的阿特拉津原药。配置固体培养基时加入适量的琼脂粉。高温灭菌备用。

1.4 降解菌的富集、驯化和分离 称取5g土样加入到100mL含有以阿特拉津作为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中，阿特拉津初始浓度为50mg/L，置于摇床中，黑暗下，30℃，150r/min，振荡培养7d，然后吸取10mL培养液，接种到含有更高浓度阿特拉津的无机盐液体培养基中。每次富集培养中设置的阿特拉津浓度均较前次增加50mg/L，直至培养基中阿特拉津的浓度达到500mg/L。将富集的菌群液部分在-80℃保存，其余用于后续试验。将最终富集的菌群液分别稀释10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍，然后用涂布器将稀释的菌液涂布到以200mg/L阿特拉津作为碳氮源的无机盐固体培养基中，5d之后挑取颜色、形态不相同并且周围出现透明圈的菌落进行纯化。将纯化后菌株接种于以200mg阿特拉津作为唯一碳氮源的无机盐固体平板上，对其降解阿特拉津能力进行验证。

1.5 降解菌株鉴定

1.5.1 菌株生理生化特征鉴定 将多次纯化的菌株MSD6，参照《常见细菌鉴定手册》对其进行生理生化特性鉴定[7]。

1.5.2 分子鉴定 以菌株MSD6的基因组DNA为模板，对其16S rRNA基因进行克隆和分析。16S rRNA的PCR引物为：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1541R：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，共30个循环；最后72℃，10min。PCR扩增产物经试剂盒回收后与pMD18-T Vextor连接，转入大肠杆菌中，用载体通用引物验证后送至擎科公司测定全长序列。序列在NCBI网站进行Blastn比对，然后利用MEGA6.0软件中的邻近法（Neighbor joining）构建系统发育树，进行1000次重抽样评估，其他参数为默认值。

1.6 分离菌株在含有阿特拉津培养基中的生长特性测定 将分离的菌株MSD6接种至LB液体培养基中，30℃，150r/min，振荡培养24h，然后将菌液8000r/min离心10min，弃上清，收集菌体，用无菌水配制成菌悬液（OD600=0.1）。将菌株MSD6的菌悬液（OD600=0.1）按1%接种量分别接种到LB培养基和含有200mg阿特拉津的无机盐培养基中，30℃，150r/min，振荡培养，每间隔4h取样1次，测定培养液的OD600值，以培养时间作为横坐标，OD值作为纵坐标，做出4株菌的生长曲线。

1.7 不同培养条件对菌株MSD6生长和降解阿特拉津的影响 培养基初始pH值设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6个处理；盐浓度处理分别设置5个NaCl质量分数（1%、2%、4%、6%、8%）。將菌株MSD6的菌悬液（OD600=0.1）接种到含有100mg阿特拉津的无机盐液体培养基中，接种量为1%菌悬液。在黑暗下，30℃，150r/min，振荡培养48h后取样，测定菌株的生物量和培养液中的阿特拉津含量。生长量测定采用OD600值法。阿特拉津测定参考王静等的方法[8]。温度条件设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃共6个处理。

2 结果与分析

2.1 阿特拉津降解菌株的鉴定 经过63d的富集培养，将富集液梯度稀释后涂布于含有200mg阿特拉津的LB固体平板上，培养后，挑取产生透明圈的单菌落，经纯化后的菌株MSD6再次接种到含有200mg阿特拉津作为唯一碳氮源的无机盐培养平板上，接种24h后菌落周围的阿特拉津大部分被降解（图1）。这一结果说明，菌株MSD6能够以阿特拉津作为唯一碳氮源进行生长。

生理生化鉴定结果表明，菌株MSD6为革兰氏阳性。在糖类利用方面，菌株MSD6的甘露糖和半乳糖利用为阴性，淀粉水解不确定。菌株MSD6不能水解明胶，不产生硫化氢，并且菌株MSD6的乙二酰、甲基红和脂类水解等实验也均为阴性，其他测试指标均呈阳性（表1）。利用PCR扩增获得菌株MSD6的16S rRNA基因序列，其长度为1430bp（GenBank登录号为MH698840）。通过NCBI的BLAST比对结果表明，菌株MSD6的16S rRNA基因序列与多株节杆菌属（Arthrobacter sp.）的同源性在98%以上。系统进化树分析结果表明，菌株MSD6与节杆菌属菌株THG-LS114亲缘关系最近，它们在同一聚类分支（图2）。结合菌株MSD6生理生化特性和分子鉴定结果，确定菌株MSD6为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。

2.2 阿特拉津降解菌株的生长曲线 由图3可以看出，菌株MSD6在LB培养基明显较在以阿特拉津为唯一碳氮源的无机盐培养基中的生长速度快，但菌株MSD6在2种培养基中的生长曲线的变化趋势较为相似。在LB培养基中，在0～12h期间菌株MSD6生长缓慢，为调整期；12～36h期间各菌株的生长呈对数增长，为对数生长期；培养36h后菌株生长相对平稳，为稳定期。在以阿特拉津为唯一碳氮源的无机盐培养基中，在0～24h期间菌株MSD6生长缓慢，为调整期；24～72h期间菌株的生长亦呈对数增长，为对数生长期；培养72h后菌株的生长均进入稳定期。

2.3 培养基初始pH对菌株MSD6生长和降解阿特拉津特性的影响 由图4可知，培养基初始pH值对菌株MSD6生长和降解阿特拉津能力有较大影响，并且菌株MSD6对酸碱环境有一定的耐受性。此外，从图4的数据还可以看出，菌株MSD6对碱性环境的耐受性稍强于对酸性环境的耐性。在pH4～5条件下，菌株MSD6培养液的OD600值分别为0.206和0.226，阿特拉津的含量分别为89.564mg/L和78.336mg/L；而在pH9～10的培养条件下的OD600值分别为0.386和0.208，阿特拉津的含量分别为69.113mg/L和80.882mg/L。菌株MSD6生长最适宜pH值为6～7，在此酸碱度下其降解阿特拉津能力也最强。在pH为6～7时，菌株MSD6培养液中阿特拉津含量分别为10.861mg/L和9.341mg/L。

2.4 培養温度对菌株MSD6生长和降解阿特拉津特性的影响 从图5可知，菌株MSD6生长的最适温为30℃，并且其对高温相对更为敏感。菌株在30℃培养温度下，其生长量最大，生长量OD600值为1.035，并且降解阿特拉津能力最强，培养液中阿特拉津含量仅为9.141mg/L，降解率为90.859%。当培养温度超过35℃时，菌株MSD6的生长速度和阿特拉津降解能力均大幅度降低。在35℃培养条件下，菌株MSD6的生长量OD600值为0.603，较最高值降低了41.74%，培养液中的阿特拉津含量为43.067mg/L。当培养温度达到45℃时，菌株MSD6生长极为缓慢，其生长量OD600值为0.066，培养液中的阿特拉津含量为93.853mg/L，仅降解了6.147%。

2.5 NaCl对菌株MSD6生长和降解阿特拉津特性的影响 从图6可以看出，菌株MSD6对低盐胁迫有一定的适应性，而高盐胁迫则明显抑制菌株MSD6的生长和降解阿特拉津的能力。1%NaCl处理对菌株MSD6的生长速度和阿特拉津降解能力无显著影响，菌株MSD6的生长量和阿特拉津降解率与无NaCl处理相近。当NaCl浓度达到2%时，菌株MSD6的生长量和阿特拉津降解率仅有小幅度降低，但其降解率仍达到84%以上。在4%NaCl浓度下，菌株的生长量OD600值仍达到了0.455，阿特拉津降解率也达到了40%以上。但NaCl浓度达到6%以上时，菌株MSD6的生长量和阿特拉津降解率大幅度降低。当NaCl浓度达到8%时，其生长量OD600值和降解率仅为0.096和5.1%。

3 结论与讨论

3.1 结论 研究筛选出1株能高效降解阿特拉津的菌株MSD6（GenBank登录号为MH698840）。该菌株能够以阿特拉津作为唯一碳氮源生长，其对阿特拉津的降解率可达90%以上。菌株MSD6对酸碱环境均有一定的耐受性，其生长的适宜pH为6～7；在此pH范围内其生长量OD600值接近于1.00，阿特拉津降解率分别为89.14%和90.66%。菌株MSD6对高温的耐受性较差，其最适宜的生长温度为30℃，生长量OD600值为1.035，阿特拉津降解率为90.85%。菌株MSD6对NaCl具有较好的耐性。在4%NaCl条件下，菌株MSD6仍可较好的生长，阿特拉津的降解率为43.91%。研究结果表明，菌株MSD6具有较好的应用和开发潜力。

3.2 讨论 节杆菌（Arthrobacter sp.）是土壤中较为常见的细菌种类，其不仅是土壤有机物的主要分解者，而且也能降解多种环境污染物。目前已报道的阿特拉津降解菌中节杆菌属（Arthrobacter sp.）占较大的比例。研究分离的菌株MSD6能够以阿特拉津作为唯一碳氮源生长，并且该菌株对阿特拉津有较高的降解能力。菌株MSD6在48h内对阿特拉津的降解率可达到90%以上。虽然目前已报道了多株可降解阿特拉津的节杆菌属菌株，但菌株MSD6的生理生化特征与它们有较大差异。菌株MSD6革兰氏染色显阳性，而菌株FM362[9]和AT2[10]为阴性。在碳源利用上，菌株MSD6可以利用乳糖和麦芽糖，而菌株T3AB1则不能以这两种糖作为其碳源[11]。菌株MSD6的甲基红试验为阴性，柠檬酸利用为阳，而菌株AT1恰好与MSD6相反[12]。菌株MSD6蔗糖利用为阳性，不产生H2S，淀粉水解不明确，而菌株Z42的蔗糖利用为阴性，可产生H2S，淀粉水解为阳性[13]。菌株MSD6吲哚实验为阳性，乙二酰实验为阴性。洪青等分离的菌株X-4则表现为吲哚阴性和乙二酰阳性[14]。菌株AG1[15]和菌株ADH2[16]能液化明胶，但AG1不能水解淀粉而ADH2可水解淀粉，而菌株MSD6则显现出水解淀粉不确定及明胶液化阴性的特征。菌株MSD6的脲酶实验为阳性，而杨合同等[17]筛选的菌株SD41则显示出脲酶实验阴性。这些结果表明，菌株MSD6与上述菌株应为节杆菌属中的不同近源种。

虽然菌株MSD6显示出较高的阿特拉津降解能力，但对其降解代谢的机制还并不清楚。根据之前的研究报道，微生物降解阿特拉津主要受基因调控，但不同属种间差异较大。在假单胞菌Pseudomonas sp. ADP中，阿特拉津降解是受基因atzA、atzB、atzC、atzD、atzE和atzF调控[18]，而菌株Pseudomonas sp. D3-1l中参与阿特拉津降解的基因只有atzA、atzB和atzC[19]。节杆菌属（Arthrobacter sp.）中调控降解阿特拉津的基因通常为trzN、atzB和atzC，如A. aurescens TC1[20]和A. histidinolovorans KU001[21]，而菌株Arthrobacter sp. D6r1-2则只含有trzN和atzC[19]。因此，探索菌株MSD6阿特拉津降解基因将是后续研究的一个方向。

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（責编：徐世红）