EGFR在鼻咽癌临床分期中的作用

颜文杰，李 湘，黄嘉韵

（广东省中西医结合医院耳鼻喉科，广东佛山528200）

EGFR在鼻咽癌临床分期中的作用

颜文杰，李 湘，黄嘉韵

（广东省中西医结合医院耳鼻喉科，广东佛山528200）

目的 探讨EGFR在鼻咽癌临床分期中的作用。方法 将鼻咽未分化非角化癌60例及鼻咽良性病变（慢性鼻咽炎及腺样体组织）30例的病理组织，利用免疫组化二步法检测其中EGFR的表达情况，结果经IPP6.0进行图像分析，并将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果 EGFR在鼻咽癌及慢性鼻咽炎病理组织中，都存在EGFR的表达，并在鼻咽未分化非角化癌组织中高表达，其MOD（EGFR）与鼻咽良性病变组织相比，存在显著性差异（p=0.004＜0.01），并且MOD（EGFR）与鼻咽癌的临床分期存在正相关性，相关系数0.786，鼻咽癌组织EGFR的表达与T分期正相关，相关系数0.722，与N分期存在一定相关性，N2与N3之间MOD（EGFR）无显著性差异（p＞0.05），剩余组间比较均有统计学意义（p＜0.05），并且MOD（EGFR）随着N分期的升高，有逐渐升高的趋势，但N分期与MOD（EGFR）的相关系数仅为0.250；结论 在鼻咽癌及鼻咽良性病变病理组织中，都存在EGFR的表达，但在鼻咽癌组织中高表达，EGFR表达可能与鼻咽癌肿瘤细胞增殖活跃度密切相关；鼻咽病理组织中EGFR的免疫组化测定作为一种判断鼻咽肿瘤细胞增殖情况的指标，在临床中值得推广

鼻咽癌；表皮生长因子受体；免疫组织化学；显微图像分析

EGFR（Epidermal growth factor receptor，EGFR）属I型跨膜酪氨酸激酶受体（Tyrosine kinase receptor，TKR），是原癌基因c-erbB1的表达产物，具备酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性，在大多数正常细胞表面均有表达［1］。EGFR于上皮组织中过度表达，与肿瘤的增殖调节失控密切相关，是恶性肿瘤发病的重要机制，在许多上皮来源肿瘤，EGFR都存在高表达，其与肿瘤发病、病理分型、临床分期、放疗敏感性等高度相关，其作用机理可能与细胞增殖调节失控、促进肿瘤血管增生、阻滞细胞凋亡等有关［2］。

鼻咽癌主要发生在中国及东南亚各国，尤其以我国广东省的珠江流域及西江流域一带最为高发。当前，临床上用于鼻咽癌诊断初筛最常用的是EB二项检查，包括有VCA-IgA（EB病毒壳抗原抗体IgA）、EA-IgA（EB病毒早期抗原抗体IgA）。对于诊断鼻咽癌，VCA-IgA具有较高的敏感性，但是特异性较差，而EA-IgA的诊断特异性则较高，但是敏感性较差。在鼻咽癌患者中，EB病毒抗体阳性率高达93%左右［3］。由此可见，EB二项的检测是临床筛查鼻咽癌的重要指标。但是，目前的研究还不能证明EB病毒抗体的水平能反应患者体内肿瘤负荷的变化或作为鼻咽癌预后判断的生物学指标，在放化疗后生存5年以上肿瘤治疗达到CR无复发和转移的病人中，有很多患者仍保持着较高的EB病毒抗体滴度［4］。

本研究通过测定鼻咽癌及鼻咽良性病变病理组织中EGFR的平均光密度MOD（mean of optical density）值，了解EGFR在鼻咽癌及鼻咽良性病变组织中的表达情况，并探索EGFR在鼻咽癌临床分期中的作用及相关性，试图找到一种相较EB两项更能够反映鼻咽癌肿瘤细胞增殖情况的指标，具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源和临床资料

收集2015年1月至2017年7月在我院住院行病理活检确诊的初诊鼻咽癌患者60例，作为实验组，同期随机选取病理报告诊断为鼻咽良性病变（鼻咽慢性粘膜炎及腺样体组织）30例，作为对照组。实验组中患者年龄25岁～80岁，平均（51.12±12.87）岁，其中男性41例，女性19例，鼻咽癌病人均行鼻咽、颈部MRI，胸片、肝胆脾胰彩超、全身骨扫描检查，明确TNM分期，T114例，T221例，T321例，T44例；N015例，N121例，N219例，N35例；M056例，M14例；按2003年UICC/AJCC修定的鼻咽癌国际分期标准确定临床分期，临床分期I期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例；对照组中患者年龄4岁～73岁，平均（36.83±21.91）岁，其中男性17例，女性13例。

1.2 仪器和试剂

鼠抗人EGFR单克隆抗体、免疫组化二步法广谱染色试剂盒由金域检验公司提供。半自动石蜡切片机、电热恒温水槽、全自动染色封片机、微波炉、倒置显微镜等实验仪器由金域病理科提供。

1.3 免疫组织化学方法

采用免疫组化（EliVisionTM二步法）进行EGFR抗体染色，操作步骤按以下操作流程进行。用己知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

操作流程具体如下：1、切片（4 μm 连续切片）；2、烤片（60℃ 60 min）；3、切片脱蜡至水（二甲苯 15 min）；4、梯度酒精脱水 5、3%H2O2 室温 15 min；6、PBS 冲洗 3×3 min；7、将切片放置在枸橼酸中高压抗原修复（喷气后 1’30”）；8、PBS 冲洗；9、滴加 1 抗，室温放置 60 min 孵育；10、PBS 冲洗 3×3 min；11、滴加试剂 1（红）常温 20 min；12、PBS 冲洗 3×3 min；13、滴加试剂 2（紫）常温 20 min；14、PBS 冲洗 3×3 min；15、DAB 显色；16、自来水冲洗；17、苏木素复染、封片；18、脱水、透明、封片。

1.4 结果判定

利用Olympus显微镜先在（×100）镜下拍照，了解EGFR在整张切片的表达大致情况，再在（×400）镜下每张切片随机选取5个视野（尽量减少无效的留白区域），使用IPP6.0专业图像分析软件，首先校正光密度；选取图像中的AOI（area of interest），即EGFR蛋白表达区域（免疫组化染色呈黄色或棕黄色的区域），接下来再将AOI区域行灰度处理，计算其累计光密度值IOD（integrated optical density）的总和SUM（IOD），然后圈定并计算有效病理组织区域的面积area，得到选择区域内的光密度平均值SUM（IOD）/area，定义为M0D（Mean of optical density），结果取5个视野下测得的的M0D的算数平均值。

1.5 统计方法

统计软件采用SPSS19.0，做数据统计分析，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，各临床分期、TNM分期组间比较采用q检验（Newman-Keuls法）多重均数比较，并在比较前作方差齐性检验，MOD（EGFR）与各临床要素的相关性用多元线性回归分析，并计算相关系数。

2 实验结果及结论

2.1 EGFR的表达形式

在鼻咽粘膜慢性炎症组织中，EGFR主要表达在上皮细胞，尤其在基底细胞层的细胞膜上，胞浆内也呈现弥散状表达，EGFR在炎性淋巴细胞中是无表达的，见图1。

图1

在鼻咽癌细胞中，EGFR都存在不同程度的表达。EGFR主要表达在癌细胞膜周围，表现出类似串珠状的分布，胞浆内也可呈现一定数量的颗粒状阳性表达。见图2。

图2

2.2 MOD（EGFR）在鼻咽癌及鼻咽良性病变中的总体比较

从表1及图3可以得出，两组MOD（EGFR）经t检验，差异有统计学意义，且实验组EGFR表达明显高于对照组（p=0.004<0.01）。

表1 两组MOD（EGFR）比较

图3 MOD对照图

2.3 EGFR与鼻咽癌临床分期及TNM分期的相关性：

2.3.1 鼻咽癌临床分期与MOD（EGFR）的相关性（见表2）

表2 不同临床分期中MOD（EGFR）比较

图4

不同临床分期组间经方差齐性检验，X2=7.043，p=0.0705>0.05，基于方差齐的不同分期鼻咽癌患者MOD（EGFR）采用q检验（Newman-Keuls法）多重均数比较（见表3）：

表3 不同临床分期中MOD(EGFR)的组间多重均数比较

由表3可见，Ⅰ期与Ⅱ期比较，MOD（EGFR）的差异无统计学意义（p>0.05），其他各组间两两比较，MOD（EGFR）的差异都存在显著性（p<0.01），并与临床分期正相关，随分期的升高，MOD（EGFR）也呈现增大的趋势（见表2及图4）。并将临床分期与MOD（EGFR）进行相关回归分析，MOD（EGFR）与临床分期存在显著正相关性（p=0.000<0.01），相关系数是0.786。

2.3.2 鼻咽癌TNM分期与MOD（EGFR）的相关性

表4 MOD（EGFR）在不同T、N分期中的比较

图5

表4和图5可以看出不同T、N分期患者的各组整体均数不相等（p＜0.01），经方差分析，不同T分期组间经方差齐性检验，X2=2.564 5，p=0.464＞0.05，方差齐，不同T分期鼻咽癌患者MOD（EGFR）采用Newman-Keuls法多重均数比较结果如下：各组间MOD（EGFR）均存在显著性差异（p＜0.01），随着T分期的升高，MOD（EGFR）逐渐升高，T分期与MOD（EGFR）呈正相关，相关系数为0.722。不同N分期组间经方差齐性检验，X2=0.340 8，p=0.952＞0.05，结果显示方差齐，不同的N分期间MOD（EGFR）使用Newman-Keuls法多重均数比较，结果显示：N2与N3之间MOD（EGFR）差异无统计学意义（p＞0.05），其余各组间均存在差异（p＜0.05），随着N分期的升高，MOD（EGFR）有逐渐升高的趋势，但N分期与MOD（EGFR）的相关系数仅为0.250。由于M1只有4例，而M0有56例，由于两组间的样本量差别太大，所以组间比较无意义。

3 讨论

EGFR的高表达可致上皮细胞癌变，促进新生血管形成、肿瘤细胞生长增殖、侵袭及远处转移［5］。本研究中，在鼻咽病理组织的鳞状上皮细胞中，EGFR在基底层细胞的表达相比棘细胞层，其阳性表达更强，这可能间接反应EGFR与调节上皮细胞的分化过程有一定关联。Herbst［6］等研究表明在大部分实体肿瘤中，EGFR均有高表达。本研究发现，EGFR在鼻咽良性病变及肿瘤组织细胞的胞膜和胞浆中均有表达，其主要表达在细胞膜上，EGFR在鼻咽未分化型非角化癌的表达明显高于鼻咽良性病变组织中的表达，结果存在显著性差异（p=0.004＜0.01）。但因为鼻咽良性病变的选择上有一部分是儿童鼻咽腺样体组织，两组患者的年龄比较存在差异（p＞0.05），可能不能完全排除年龄因素的影响。

贾代杰［7］研究显示，在鼻咽癌患者组织中，EGFR的阳性表达率为73.8%，而在慢性鼻炎患者组织中的阳性表达率分别为32.3%，两组比较均有差异（p＜0.05）。鼻咽癌组织中EGFR蛋白的表达与TNM分期、颈淋巴结转移有密切关联（p＜0.05）。本研究结果与此相似，EGFR的表达与临床分期存在显著正相关性，相关系数为0.786。并且与T、N分期有一定的相关性，其中EGFR与T分期呈正相关，相关系数为0.722，与N分期的相关系数仅为0.250，N2与N3之间MOD(EGFR)差异无显著性（p＞0.05），剩余组间比较差异有统计学意义（p＜0.05），并与N分期存在一定正相关，随着其N分期升高，MOD（EGFR）也逐渐升高。该结果证明EGFR可能和鼻咽癌发病及进展相关，EGFR可能与肿瘤细胞增殖活跃相关。本研究通过对初诊鼻咽癌及鼻咽良性病变病理组织中MOD（EGFR）的测定，探索EGFR与鼻咽癌临床分期及TNM分期的相关性及其在鼻咽癌预后判断上的辅助作用。

王树森［8］利用免疫组织化学方法检测55例鼻咽癌组织，发现EGFR阳性表达率为70.9%，EGFR阳性患者5年生存率下降。可能与EGFR信号途径决定肿瘤细胞放射敏感性有关。Akimoto［9］等对9种不同肿瘤细胞的大鼠进行试验，EGFR的表达强度与放射诱导的细胞凋亡水平呈负相关，曲媛等［10］研究发现血浆和组织中EGFR和VEGF表达水平可能与鼻咽癌远处转移相关，与放化疗敏感性呈负相关。放疗前对鼻咽癌患者病理组织中EGFR进行检测，可预测肿瘤对放疗的敏感度［11］。本研究尚未涉及EGFR与放射敏感性的关系，对入组的病人进一步长期随访，并了解患者的生活质量，从而探索放化疗后的肿瘤转归预后，进一步探索EGFR与鼻咽癌生存时间和生活质量的相关性，是未来研究和努力的方向。

［1］JORISSEN R N,WALKER F,POULIOT N,et al.Epidernal growth factor receptor∶mechanisms of activation Signaling［J］.EXPCell Res,2003,284∶31.

［2］颜文杰,夏纪严.EGFR及EGF在鼻咽癌中的作用及临床意义［J］.广东医学,2010,31（9）∶1201-1203.

［3］HO JH C,LAU W H,KWAN H C,et al.Epstein-Barr virus-specific IgA and IgG serum antibodies in nasopharygeal carcinoma［J］.Brit.J.Cancer,1995,34∶655-659.

［4］洪明晃,郭翔,等.鼻咽癌［M］.北京∶中国医药科技出版社,2003∶315.

［5］REGO R L,FOSTER N R,SMYRK TC,etal.Prognostic effect of activated EGFR expression in human colon carcinomas：comparison with EGFR status［J］.Br JCancer,2010,102（1）∶165-172.

［6］HERBSTR S.Review of epidermal growth factor receptor biology［J］.Int JRadiatOncol Biol Phys,2004,59（2）∶21-26.

［7］贾代杰.表皮生长因子受体和血管内皮细胞生长因子在鼻咽癌中的表达及其临床意义［J］.中国临床医生,2017,45（5）∶66-68.

［8］王树森,管忠震,向燕群.鼻咽癌组织中EGFR和p-ERK蛋白表达的检测及意义［J］.中华肿瘤杂志,2006,28（1）∶28-31.

［9］AKIMOTO T,HUNTER N R,BUCHMIUER L,et a1.Inverse relationship between epidermal growth factor receptor expression and radiocurability ofmurine carcinomas［J］.Clin Cancer Res,1999,5∶2884-2890.

［10］曲媛,车轶群,沈迪,等.N2-3期鼻咽癌EGFR、VEGF、EBER表达与放化疗敏感性的关系［J］.中国肿瘤,2014（1）∶72-76.

［11］王莉,潘艳东,邓辉.EGFR与鼻咽癌放射敏感性及相关性的研究进展［J］.临京医学工程,2017,24（2）∶287-288.

Effect study on EGFR in clinicalstaging of nasopharyngeal carcinoma

YAN Wen-jie,LI Xiang,HUANG Jia-yun
（Guangdong Province Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Foshan 528000,China）

Objective To investigate the role of EGFR in the clinicalgrading of nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods Examining the expression of EGFR by Two-step Method in immunohistochemistry on the pathological tissue specimens from 60 NPC patients and 30 patients with benign nasopharyngeal diseases,the resultwas analyzed by the IPP6.0.The clinical pathological features of these specimens were also taken into account.Results The expression of EGFR was found in the pathological tissue specimens of both NPC patients and chronic nasopharyngitis patients but higher in the specimens of NPC patients.The MOD (EGFR)of NPC specimens have significant difference(p=0.004＜0.01)with chronic nasopharyngitis specimens.Also,MOD(EGFR)has positive correlation(correlation coefficient=0.786)with clinical staging ofnasopharyngeal carcinoma.The expression of EGFR in nasopharyngeal carcinoma tissuewas positively correlated with T scale(correlation coefficient=0.722).Itwas also correlated with Nscale,there were no significant difference(p＞0.05)between MOD (EGFR)of N2 and N3,but significant difference(p＜0.05)was found between other groups,the MOD(EGFR)gradually increased with the upgrade of N scale,but the correlation coefficient between Nscale and MOD (EGFR)was only 0.250;Conclusion The expression of EGFR was found in the pathological tissue specimens of both NPC patients and chronic nasopharyngitis patients but higher in the specimens of NPC patients.The expression of EGFRmay be closely related to the proliferation vitality of NPC tumor cells.As an indicator of nasopharyngeal tumor cell proliferation,immunohistochemical exanmination of EGFR worth popularizing in clinicalpractice.

nasopharyngeal carcinoma;epidermal growth factor receptor;immunohistochemistry;microscopic imageanalysis

R766.3

A

1008-0171（2017）06-0062-06

2017-10-09

广东省佛山市卫生局医学科学技术研究基金（2015218）

颜文杰（1984-），男，江西上饶人，广东省中西医结合医院主治医师。

邓军文 dengjunwen69@126.com】