冠心病合并慢性牙周炎患者外周血调节性T细胞检测的临床意义

王 倩, 丁 畅, 王 治, 吴 娟

(1. 江苏省南京市胸科医院 心内科, 江苏 南京, 210029; 2. 江苏省南京市口腔医院 牙周科, 江苏 南京, 210008)

冠心病合并慢性牙周炎患者外周血调节性T细胞检测的临床意义

王 倩1, 丁 畅1, 王 治1, 吴 娟2

(1. 江苏省南京市胸科医院 心内科, 江苏 南京, 210029; 2. 江苏省南京市口腔医院 牙周科, 江苏 南京, 210008)

冠心病; 牙周炎; 调节性T细胞; 动脉粥样硬化

炎症反应不仅在冠状动脉粥样硬化性心脏病(AS)斑块的形成和发展中起着重要作用，还决定着它的稳定性[1]。牙周炎是牙周支持组织的慢性炎症，能够通过被感染的牙周组织释放炎症介质，诱导内皮细胞功能障碍，导致AS[2]。T淋巴细胞介导的细胞免疫参与了AS的炎症反应过程，在促进斑块进展和保持斑块稳定中都起到一定的作用[3-4]。调节性T细胞(Treg)的数量减少或者功能下降、甚至其分化及分布的异常都会导致自身免疫失调，这可能是T淋巴细胞参与AS进展的重要作用机制[5]。本研究检测患者的CD4+CD25+FoxP3+Treg含量以及细胞因子TGF-β1的浓度，分析冠心病合并慢性牙周炎患者的调节性T细胞数量及功能的变化，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月—2017年9月南京市胸科医院心血管内科首诊疑似冠心病住院患者122例，年龄40～65岁，平均(56.74±6.82)岁，男62例，女60例。根据冠状动脉造影结果和牙周炎诊断标准将患者分为4组。对照组(C组)32例，男15例，女17例，年龄(56.48±5.93)岁，冠脉造影正常且牙周组织健康或仅有牙龈炎; 冠心病组(CHD组)28例，男15例，女13例，年龄(58.16±7.19)岁，有冠心病但牙周组织健康或仅有牙龈炎; 冠心病合并牙周炎组(CHD-P组)32例，男17例，女15例，年龄(57.40±7.47)岁; 牙周炎组(P组)30例，男15例，女15例，年龄(55.01±6.60)岁，冠脉造影正常有慢性牙周炎。

排除标准: 合并感染性疾病; 应用炎症抑制药物; 严重肝肾功能不全者; 周围血管栓塞性疾病者; 恶性肿瘤患者; 糖尿病和风湿性疾病; 严重高脂血症(总胆固醇>6.5 mmol/L、甘油三酯>3.0 mmol/L、低密度脂蛋白>4.0 mmol/L)和高血压病3级以上的患者。研究经伦理委员会批准，并获取研究对象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 冠心病的诊断: 行冠状动脉造影并依据哈里森内科学标准诊断，冠状动脉狭窄<50% 者为正常。冠状动脉狭窄程度采用Gensini(GS)评分法进行评分; 对主要冠状动脉左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉中任何一支狭窄进行积分: ≤25%为1.0分，26%～49%为1.5分，50%为2.0分，51%～74%为3.0分，75%为4.0分，76%～89%为6.0分，90%为8.0分，91%～98%为12.0分，99%为16.0分，100%为32.0分。

1.2.2 牙周炎的诊断: 由南京市口腔医院同一位牙周科医生依据患者牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齿松动等方面进行诊断。牙周组织健康或仅有牙龈炎者列为无牙周炎。

1.2.3 标本采集: 抽取受试者入院后第2天空腹静脉血12 mL, 其中6 mL全血样本送本院检验中心进行常规血脂、CRP检测; 2 mL全血样本采用EDTA抗凝行流式细胞术检测; 4 mL全血样本用肝素抗凝管采集送本院中心试验室行ELISA检测。

1.2.4 CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T的检测: 抽取静脉血1 mL, 用PBS 1︰1稀释，加入等量的人淋巴细胞分离液中, 2 200 r/min离心20 min, 取单个核细胞层，加入PBS洗涤, 1 500 r/min离心10 min去上清液; 取A(同型对照管)、B(检测管)两管，每管加入约5.0×105个细胞，以CD4/CD25混合抗体孵育30 min, 洗涤后加入1 mL固定/破膜工作液孵育60 min, A管加入IgG抗体，B管加入Foxp3抗体，孵育30 min, 洗涤后加入适量流式缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测。试剂购自美国BD公司。

1.2.5 TGF-β1浓度的检测: 静脉血4 mL以4 ℃低温离心机3 000 转/min离心20 min, 收集血清并分装至多个1.5 mL的EP管中，封膜，编号, -80 ℃超低温冰箱保存待用。取上清液(血浆)用ELISA法测定TGF-β1浓度。TGF-β1ELISA试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司。

1.3 统计学处理

用SPSS 18.0 软件进行分析，计数资料采用卡方检验; 计量资料方差齐性检测后，正态分布数据以均数±标准差表示，多组均数间采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK方差分析; 相关检验性采用Spearman。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

C组、CHD组、CHD-P组和P组在年龄、性别、吸烟率、血压、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、CRP等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。CHD组的GS评分为(13.91±6.37)，较C组(2.97±1.90)和P组(2.90±1.91)显著升高 (P<0.01)。CHD-P组的GS评分为(22.98±13.36)，较C组和P组显著升高(P<0.01)。CHD-P组较CHD组显著升高(P<0.01)。C组和P组无显著差异(P=0.973)。CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T在CHD-P组中为(1.97±0.38)%，较C组(2.58±0.74)%、CHD组(2.34±0.51)%和P组(2.34±0.34)%显著降低(P<0.01); CHD组和P组较C组下降，但差异无统计学意义(P>0.05); CHD组与P组无显著差异(P=0.983)。CHD-P组TGF-β1水平为(13.41±2.96) μg/L, 较C组(23.32±5.60) μg/L、CHD组 (18.98±3.95) μg/L和P组(18.41±3.54) μg/L显著降低(P<0.01)。CHD组和P组较C组均降低，且差异均有统计学意义(P<0.01); CHD组较P组无显著差异(P=0.606)。Spearman相关性分析发现，血浆TGF-β1浓度与CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T呈中等相关(r=0.455,P<0.01)。

表1 4组一般资料比较

3 讨 论

研究[6]认为冠心病的主要病因是AS，但是在AS的发展过程中，细胞基质的反应、各种细胞因子以及生长因子的产生与作用，都与炎症反应过程很类似。AS是一种炎症性疾病，炎性细胞浸润是AS的重要过程。多种免疫细胞如巨噬细胞、DC细胞、淋巴细胞参与AS斑块的形成，其中T细胞在斑块形成各个时期均发挥着重要的作用，而且斑块部位浸润的T细胞中最主要的是CD4+T细胞[7]。

近年来，大量的流行病学调查[8]显示牙周炎患者发生AS的风险增高，病因学调查[9]提示牙周炎患者罹患心血管疾病的风险比无牙周炎患者高，重度牙周炎与血管内膜增厚相关。牙周炎还可以导致血小板活化因子和脂蛋白相关性磷脂酶A2等炎症因子释放，它们也是已知的冠心病的危险因子，可以促进血小板聚集，加剧冠状动脉粥样硬化斑块内的炎症反应，使斑块的不稳定性加剧[10]。本研究中CHD-P组较CHD组GS评分明显升高，提示CHD-P组较CHD组患者的冠状动脉的狭窄程度更高，进而预测慢性牙周炎可能与冠状动脉粥样硬化的进展相关。

牙周炎引起的感染诱导出T淋巴细胞免疫应答反应，不同亚群的T淋巴细胞在AS形成过程中的作用不同。Treg细胞是负向调节免疫T细胞，通过分泌抑炎因子IL-10和TGF-β1对炎症反应负调控，抑制AS的形成。有研究[11]发现，冠心病患者外周血中Treg细胞数目和功能均下调，且分泌的细胞因子IL-10和TGF-β1水平也随之下降。Hagiwara等[12]研究表明，牙龈卟啉单胞菌疫苗舌下使用可缓解牙龈卟啉单胞菌感染引起的AS斑块形成，且上调淋巴结Treg细胞数量。还有研究提示牙龈卟啉单胞菌可分泌外膜蛋白、牙龈素，当毒力因子进入循环系统能诱导内皮细胞的促AS应答反应[13]。由此可见，Treg在T淋巴细胞参与的AS过程中可能起关键作用。

CD4+CD25+Foxp3+Treg是最为重要的Treg细胞。Foxp3在CD4+T细胞的稳定表达是Treg分化过程完成的标志，Foxp3是控制Treg发育及发挥其生物功能的重要参与者[14]。Roland等[15]利用白喉毒素注射获得选择性缺失Foxp3的小鼠，将小鼠骨髓移植至Ldlr-/-小鼠，结果显示Foxp3缺失后AS斑块比对照组明显增大，血浆胆固醇也明显增高，证明Foxp3+Treg可通过调节脂蛋白代谢抑制AS。本研究中CHD-P组较CHD组、P组、C组的CD4+CD25+FoxP3+Treg/CD4+T均明显下降，提示冠心病合并慢性牙周炎患者的Treg数量明显下降，推测牙周炎加重了冠心病患者的慢性炎症反应、促进了冠心病患者AS斑块的进展。本研究中CHD组、P组和C组的CD4+CD25+FoxP3+Treg/CD4+T组间无显著差异。作者推测虽然CHD组和P组患者存在慢性炎症反应，但是该反应相对比较轻微是不同于急性炎症反应的，因此与C组患者间无明显差异，也有可能是本研究的样本量偏小所致。

TGF-β是许多具有共同生物学特性的信号分子组成的大家族，它参与了Treg细胞分化的许多环节。TGF-β1是TGF-β1家族中的一员，它参与了冠状动脉粥样硬化的形成、冠状动脉的狭窄、心肌梗死后重塑、细胞凋亡等过程，反映了Treg的功能。有研究[16]表明斑块不稳定的冠心病患者血清TGF-β1水平较正常人明显降低; 心肌梗死者的血浆活性TGF-β1水平更低。由此可见，血浆TGF-β1浓度水平的降低更易于斑块的破裂和血栓的形成。TGF-β1在AS的形成过程中是炎症免疫调节和斑块稳定因子[17]。本研究中CHD-P组、CHD组、P组的TGF-β1水平均比C组降低, CHD-P组的TGF-β1水平较CHD组进一步下降。另外，本研究提示患者的血浆TGF-β1水平与Treg含量呈中等相关。作者认为，牙周炎与冠心病都存在慢性炎症反应，慢性牙周炎导致了冠心病患者TGF-β1水平的进一步下降，继而引起 Treg的含量和功能的降低，破坏了AS斑块的稳定性。

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R 541.4

A

1672-2353(2017)24-142-03

10.7619/jcmp.201724059

2017-10-10

国家自然科学基金项目(81570365); 南京市医学科技发展项目(YKK15165)

丁畅