慢性阻塞性肺疾病对单个核细胞TLR 2/4信号通路的影响

吴玉英, 王晓华

(南京医科大学附属常州医院 常州市第二人民医院 呼吸科, 江苏 常州, 213003)

慢性阻塞性肺疾病对单个核细胞TLR2/4信号通路的影响

吴玉英, 王晓华

(南京医科大学附属常州医院 常州市第二人民医院 呼吸科, 江苏 常州, 213003)

目的观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)组患者外周血单个核细胞(PBMC) TLR2/TLR4、IRAK and NF-κB mRNA水平的变化。方法利用Ficoll分离法分离健康人及COPD组患者外周血单个核细胞，通过qPCR的方法检测健康人及COPD患者的TLR2/TLR4、IRAK、NF-κB mRNA的表达水平。结果COPD组单核细胞TLR2、TLR4 mRNA水平较健康人未见明显变化，但IRAK1/4以及NF-κB mRNA水平的变化相对健康对照组显著下降(P<0.05)。结论TLR2/4信号通路的表达下调参与了COPD疾病进展。

慢性阻塞性肺疾病; Toll 样受体2/4; IRAK; NF-κB

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以呼出气流持续受限为主要病理生理特征、慢性气道炎症反应为主要病理改变的临床常见病及多发病[1-2]。沈宁等[3]在研究细菌感染与免疫在COPD发病进程中的作用机制时发现，在细菌感染、香烟暴露等致病因素诱导下，Toll样受体等模式识别受体被激活，启动固有免疫，激活T淋巴细胞，发挥继发性免疫学效应，参与肺组织的损伤与破坏。还有研究者[4]在对人体和小鼠实验研究中证实，香烟烟雾的颗粒成分可以激活TLR4，可能是由TLR样受体直接识别烟雾的颗粒成分，也可能是烟雾导致上皮细胞的损伤，进而被PRRs识别。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取5名健康志愿者，均为男性，平均年龄35岁; 5名COPD组患者，均为男性，平均年龄71岁，因急性加重住院治疗，分组根据《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2015版)》。

1.2 主要试剂

Trizol购自上海普飞; M-MLV、Rnase Inhibitor以及dNTPs购自promega; oligo dT购自上海生工; Bulge-Loop TM miRNA qPCR Primer Set购自广州锐博; Primer(R&F) 由上海吉凯设计及合成; SYBR Master Mixture购自 TAKARA。

1.3 方法

1.3.1 外周血单个核细胞的提取: 抽取正常人及COPD患者外周血10 mL, 肝素抗凝，通过Ficoll Hypaque密度梯度离心法(2 000 r/min离心30 min)后吸取白膜层细胞, PBS洗涤2次(1 500 r/min离心10 min)，获得单个核细胞。

1.3.2 TLR 2、TLR4、IRAK 1、IRAK 4、NF-KB mRNA表达检测: ① RNA提取: 细胞收集入15 mL离心管中，随后12 000 g、4℃离心10 min，弃上清; 加入1～2 mL Trizol混匀后静置5 min, 随后12 000 g 4 ℃离心5 min; 取上清液加入各干净EP管，加入氯仿200 μL后充分振荡混匀，随后静置5 min, 12 000 g、4 ℃离心15 min后取上清加入等比异丙醇，充分混匀; 随后静置10 min, 12 000 g 4℃离心10 min; 此时会出现RNA异丙醇沉淀，弃上清，加入DEPC水处理的75%乙醇1 mL; 随后12 000 g 4 ℃离心5 min; 弃乙醇，空气静置2～5 min干燥沉淀，最后加入RNase-free H2O 10 μL溶解沉淀。② 逆转录反应: 反应体系: 5×Primerscript Mix Buffer 2 μL, RNA(根据测定的RNA的浓度决定使用的具体计量，每10 μL体系最多转录500 ng RNA), RNase free H2O, 共10 μL体系，反应条件为37 ℃ 15 min(逆转录), 85 ℃ 5 s(酶失活)。③ Real Time PCR反应: 引物设计: 内参基因GAPDH，上游引物序列TGACTTCAACAGCGACACCCA, 下游引物序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA, 扩增片段大小121 bp; 目的基因IRAK1，上游引物序列TGAGGAACACGGTGTATGCTG, 下游引物序列GTTTGGGTGACGAAACCTGGA, 扩增片段大小119 bp; 目的基因TLR2, 上游引物序列CGGAAGATAATGAACACCAAGAC, 下游引物序列AGATCCCAACTAGACAAAGACTG, 扩增片段大小139 bp; 目的基因NFKB1, 上游引物序列AGGATTTCGTTTCCGTTATGT, 下游引物序列CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC, 扩增片段大小92 bp; 目的基因IRAK4, 上游引物序列CCTGACTCCTCAAGTCCAGAA，下游引物序列ACAGAAATGGGTCGTTCATCAAA，扩增片段大小119 bp; 目的基因TLR4, 上游引物序列CCTGTCCCTGAACCCTATGA，下游引物序列CTTCTAAACCAGCCAGACCTT, 扩增片段大小137 bp。④ 反应体系: SYBR Green I Mix 10 μL, 引物上下游各0.4 μL, cDNA 1.2 μL, 加ddH2O至20 μL。反应条件: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s、60 ℃ 25 s共40个循环; 融解曲线反应条件为: 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

1.4 数据分析

2-△△CT方法分析基因相对表达量(即表示实验组目的基因的表达相对于对照组变化的倍数)。△CT=目的基因CT值-管家基因CT值, △△CT=实验组的△CT值-对照组的△CT值(即△△CT=刺激后目的基因的△CT值-刺激前目的基因的△CT值)，相对量RQ=2-△△CT。凝胶电泳: 用含有5 μL 0.1%溴乙锭的3%琼脂糖凝胶跑电泳分析PCR的终产物。DNA条带用Tanon 3500凝胶电泳成像系统进行显效。

2 结 果

2.1 COPD组患者TLR2和TLR4 mRNA的变化

作者收集COPD组患者和健康者外周血单个核细胞提取RNA后行实时荧光定量PCR检测TLR2、TLR4 mRNA的表达变化，利用2-△△CT法进行数据分析，结果如图1所示。COPD组TLR2 mRNA对比健康对照组的RQ值=1.214±0.184,P=0.282,n=5; COPD组TLR4 mRNA对比健康对照组的RQ值=0.913±0.172,P=0.626,n=5。2组在TLR2及TLR4 mRNA的表达水平无显著差异。

2.2 COPD组患者IRAK1/4和NF-κB mRNA的 变化

作者收集COPD组患者和健康者外周血单个核细胞提取RNA后行实时荧光定量PCR检测IRAK1、IRAK4以及NF-κB mRNA的表达变化，利用2-ΔΔCT法进行数据分析，结果如图2所示。COPD组IRAK1/4以及NF-κB mRNA对比健康对照组的RQ值分别为(0.641±0.107)、(0.3 798±0.095)、(0.3 356±0.097) (P<0.05,n=5)。结果显示, COPD患者的IRAK以及NF-κB的mRNA显著减少。

图1 COPD组及健康对照组TLR2、TLR4 mRNA水平的表达

3 讨 论

研究[5]结果显示, TLR参与了持续炎症反应，但目前对TLR信号通路的研究还较为表浅，值得进一步深入基础研究。TLRs是最主要的天然免疫识别受体，在肺部存在巨噬细胞、树突状细胞、肺上皮细胞及内皮细胞等，均表达TLR, 不同细胞主要表达的TLR不同。肺泡巨噬细胞表达TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7及TLR8, 浆细胞样树突状细胞表达TLR9及TLR7, 髓样树突状细胞则表达TLR1～TLR4。通过激活细胞内信号的级联反应导致炎症介质的产生，启动天然免疫应答[6]。目前的研究[7]多集中于TLR2及TLR4，尤其是TLR4。TLR2识别的PAMPs非常广泛，包括病毒，细菌以及寄生虫等。TLR4主要识别革兰阴性菌脂多糖(LPS)、呼吸道合胞病毒等。有研究者[8]收集因肺鳞癌行肺叶切除的癌旁组织标本50例，根据肺功能分为COPD组和非COPD组，研究结果显示 COPD组患者肺血管管壁及周围大量炎细胞浸润，细胞间质增多，管腔狭窄，平滑肌细胞增生肥大，出现明显的肺血管重建，而且通过免疫组化法发现COPD组TLR4在肺动脉血管平滑肌细胞中的表达水平明显高于非 COPD组，进一步支持TLR4信号通路参与了持续的炎症反应。

还有研究者以AECOPD患者体内单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞作为模型，结果显示基础状态下AECOPD患者TLR4、NF-KB mRNA和蛋白表达及上清中TNF-α水平均显著高于健康对照，表明AECOPD患者可能受到定植菌的长期刺激，巨噬细胞通过TLR4识别，使NF-KB处于活化状态，炎症因子TNF-α明显增高，使气道炎症持续[9]。Tohn等[10]研究显示COPD患者外周血单个核细胞表面TLR2、TLR4的表达水平与血清TNF-α、IL-6、IL-8的浓度成正相关。TLR-2主要在肺组织的肺泡巨噬细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞中表达，而不同的是, Kuroki等[11]研究发现长期受LPS刺激的单核细胞TLR-2表达下调，并且随着LPS的刺激时间越长TLR-2表达下调越明显。Droemanm[12]研究则发现COPD患者和健康吸烟者肺泡巨噬细胞表面TLR-2表达明显降低，在受到LPS刺激时非吸烟者的肺泡巨噬细胞出现TLR-2表达呈下调趋势。IRAK家族是TLRs/IL-1信号通路中的信号通路连接体和枢纽，基本上所有的TLRs信号通路都需要与它们连接，其中最重要的连接体是IRAK1和IRAK4。现有研究[13]表明IRAK1和IRAK4因具有激酶活性，在信号通路中起着正性调节的作用。

本研究结果显示, COPD组患者TLR2及TLR4在mRNA水平的表达与健康人无显著差异，但IRAK1/4及NF-κB mRNA水平的表达却显著下降，这与前提及的研究结果存在一定的差异。众所周知，当机体受到病原体感染时，炎症反应是人体进行抵抗的首要反应。炎症反应可以激活先天性免疫和适应性免疫应答，并通过此种应答来解决问题和恢复体内的动态平衡。本研究结果显示, COPD组患者TLR信号通路受到了抑制，那么必然影响炎症反应的表达。另外，此部分患者均存在慢性缺氧，长期缺氧后可导致体内细胞能量代谢异常，进而影响了信号通路的传导，甚至可出现细胞凋亡。

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Influenceofchronicobstructivepulmonarydiseaseontheexpressionoftoll-likereceptor2/4signalpathwayofperipheralbloodmononuclearcells

WUYuying,WANGXiaohua

(RespiratoryDepartment,TheSecondHospitalofChangzhou,ChangzhouAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ObjectiveTo investigate the expression changes of toll-like receptor 2/4 (TLR 2/4), IRAK and NF-κB mRNA on monocyte-derived dendritic cells of patients with chronic obstructive pulmonary disease.MethodsFicoll separation was been used to separate peripheral blood mononuclear cells of the healthy controls and patients with COPD. The expression levels of TLR2/TLR4, IRAK and NF-κB mRNA were detected for healthy controls and patients with COPD by the method of qPCR.ResultsThe expression of TLR2 and TLR4 mRNA in COPD group were similar to healthy people, but IRAK1/4 and the NF-κB mRNA expression levels were significantly lower than the healthy controls.ConclusionThe download expression of TLR2/4 signaling pathways play an important role in the progression of COPD.

chronic obstructive pulmonary disease; toll-like receptor 2/4; IRAK; NF-κB

R 441.8

A

1672-2353(2017)24-016-03

10.7619/jcmp.201724005

2017-07-22

王晓华, E-mail: xiaohuawang001@foxmail.com