MUC2转录下调对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道通透性的影响*

徐 汇 郑俊媛 范俊杰 黄春兰 曾 悦

上海交通大学附属第一人民医院消化科(201620)

MUC2转录下调对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道通透性的影响*

徐 汇#郑俊媛 范俊杰 黄春兰&曾 悦&

上海交通大学附属第一人民医院消化科(201620)

急性胰腺炎早期即可出现肠屏障功能障碍，并与疾病进展、预后有密切联系。肠黏液层作为主要肠道物理屏障之一，有助于维持正常肠屏障功能。目的观察黏蛋白MUC2在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肠道中的表达变化，探讨其在ANP肠屏障损伤中的作用。方法42只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(SO组)和ANP组，后者以胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠建立ANP模型。分别于造模后6 h、12 h、24 h获取标本，测定血清淀粉酶和D-乳酸(反映肠道通透性)水平，观察胰腺和结肠组织病理学改变，PAS/AB染色观察结肠黏液层和杯状细胞，real-time PCR检测结肠组织MUC2和促炎细胞因子表达。结果ANP大鼠模型建立成功。ANP组结肠组织损伤明显；与SO组同时间点相比，ANP组肠道通透性增加，结肠黏液层变薄，含黏液杯状细胞数减少，MUC2 mRNA表达下调，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ) mRNA表达上调，差异均有统计学意义(P<0.05)。ANP组MUC2表达与肠道通透性和促炎细胞因子表达呈显著负相关(P<0.05)。结论ANP大鼠结肠组织MUC2转录显著下调，并与肠道通透性增加和病程早期促炎细胞因子过度表达有关。

胰腺炎，急性坏死性； 黏蛋白-2； 杯状细胞； 肠道通透性

重度急性胰腺炎的最终死亡原因与多器官功能衰竭综合征(MODS)、胰腺/胰周坏死感染密切相关[1-2]。研究表明急性胰腺炎早期即可出现肠屏障功能障碍、肠道通透性增加、肠道细菌易位和肠源性内毒素血症，进而促进多器官功能衰竭发生，与疾病进展、预后有密切联系[3-6]，但肠道通透性增加在此种疾病状态下的发生机制尚未完全明确。

正常肠道屏障由物理屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障组成，肠道上皮细胞表面覆盖的胶样黏液层是肠道主要物理屏障之一，可隔绝病原菌与肠上皮细胞接触，并有助于维持正常肠屏障功能。黏蛋白MUC2是肠黏液层最主要的成分，由杯状细胞合成、分泌。本研究旨在观察急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠模型肠道中MUC2蛋白转录水平的表达变化，探讨其在ANP肠屏障损伤中的作用。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠42只，体质量200～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。牛磺胆酸钠(Sigma-Aldrich Co.)；D-乳酸检测试剂盒(比色法)(Abcam plc.)；TRIzolTM试剂(Thermo Fisher Scientific)；real-time PCR试剂盒(TAKARA BIO INC.)。

二、方法

1. 动物分组和ANP模型制备：42只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术(SO)组和ANP组，每组按标本获取时间(造模后6 h、12 h、24 h)进一步分为3个亚组。造模前12 h开始禁食，自由饮水。ANP组大鼠1%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉，上腹正中切口进入腹腔，显露胰胆管，以血管夹阻断近肝门处胰胆管，使用4号头皮静脉针于十二指肠乳头附近经十二指肠壁穿刺，逆行插入胰胆管，沿胰胆管逆行恒速(0.1 mL/min)注射3.5%牛磺胆酸钠溶液1 mL/kg。注射完毕后，针头保留5 min 后拔出，除去血管夹，关腹。SO组大鼠常规麻醉、开腹后仅翻动胰腺，随即关腹。

2. 标本获取：两组分别于造模后6 h、12 h、24 h取材，每一时点7只大鼠。动物麻醉后腹主动脉采血，3 000 r/min离心15 min分离血清，分装后-70 ℃冻存。动物处死后切取胰腺组织，4%甲醛溶液固定；取距肛门8 cm处结肠组织，分为3份，一份4%甲醛溶液固定，一份Carnoy固定液(60%甲醇+30%氯仿+10%冰乙酸)固定，一份液氮速冻后-70 ℃保存。

3. 胰腺和结肠组织病理学检查：胰腺和结肠组织4%甲醛溶液固定后常规脱水，石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察。参照Schmidt等[7]采用的方法对胰腺组织损伤进行病理学评分，总分为水肿、出血、坏死、炎症四项评分之和。

4. 血清淀粉酶检测：采用Beckman Coulter AU5800全自动生化分析仪测定血清淀粉酶水平。

5. 肠道通透性检测：参照试剂盒说明书，采用比色法测定血清D-乳酸水平。

6. 结肠黏液层和杯状细胞观察：结肠组织在室温下置于Carnoy固定液中固定4 h～2 d，甲醇脱水30 min×2次，乙醇脱水20 min×2次，二甲苯脱水15 min×2次，石蜡包埋、切片，PAS/AB染色，光学显微镜下观察结肠黏液层。参照Johansson等[8]采用的方法，每张切片随机选取3个高倍视野，计数纵切面上距表面上皮100 μm的隐窝中阳性染色杯状细胞数，结果以平均每个隐窝中含黏液的杯状细胞数表示。

7. 结肠组织MUC2和促炎细胞因子检测：采用real-time PCR检测结肠组织MUC2和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA表达。取远端结肠组织100 mg，TRIzolTM试剂抽提组织总RNA，逆转录合成cDNA，行real-time PCR扩增。MUC2、TNF-α、IL-1β、IFN-γ PCR引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

三、统计学分析

表1 Real-time PCR引物序列

结 果

一、胰腺和结肠组织病理学改变

1. 胰腺组织：光学显微镜观察显示，SO组胰腺组织完整，腺泡结构清晰，偶见轻度叶间隙增宽和少量炎性细胞浸润，未见出血、坏死，各时间点间病理学评分差异无统计学意义(P>0.05)(图1A、1B)。ANP组胰腺组织可见间质水肿、小叶间隙增宽，腺泡细胞变性坏死和炎性细胞浸润，损伤随时间延长而加重，病理学评分逐渐增高；24 h 时可见部分小叶结构破坏，片状出血和坏死，大量炎性细胞浸润，病理学评分显著高于12 h和6 h(P<0.05)(图1A、1B)。ANP组各时间点胰腺组织病理学评分均较SO组同时间点明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)(图1B)。

2. 结肠组织：光学显微镜观察显示，SO组结肠组织形态正常，黏膜层表面光滑，上皮细胞层完整，未见炎症表现，不同时间点间未见明显变化；ANP组结肠黏膜上皮和固有层腺体排列紊乱，可见部分上皮细胞脱落、缺损和炎性细胞浸润，隐窝数减少，间质水肿，损伤随时间延长而加重，24 h时损伤最为明显(图2)。

*两组间比较，P<0.05

图2 SO组和ANP组结肠组织病理学改变比较(HE染色，×400)

二、血清淀粉酶变化

与SO组相比，ANP组各时间点血清淀粉酶水平均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组血清淀粉酶水平于12 h达高峰，但6 h、12 h、24 h间差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

三、肠道通透性变化

ANP组血清D-乳酸水平于6 h开始逐渐增高，于24 h达高峰，6 h、12 h、24 h间两两比较差异均有统计学意义，且各时间点均明显高于SO组同时间点，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

*两组间比较，P<0.05

*两组间比较，P<0.05

四、结肠黏液层和杯状细胞变化

结肠组织PAS/AB染色后光学显微镜观察显示，SO组结肠黏膜上皮被一层完整的黏液层覆盖，杯状细胞内充满黏液颗粒，不同时间点间未见明显变化；ANP组6 h时即可观察到部分肠黏液层缺失，隐窝内含黏液的杯状细胞数减少；随着时间的延长，肠黏液层变薄更为明显，完整性破坏，杯状细胞中黏液明显减少(图5A)。ANP组各时间点含黏液杯状细胞数均较SO组同时间点明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，但组内6 h、12 h、24 h间差异无统计学意义(P>0.05)(图5B)。

五、结肠组织MUC2和促炎细胞因子表达变化

与SO组相比，ANP组各时间点结肠组织MUC2 mRNA均呈低表达(P<0.05)，并随时间延长而降低，但组内6 h、12 h、24 h间差异无统计学意义(图6A)。

ANP组结肠组织促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA 6 h时表达最高，随后呈降低趋势，其中IL-1β、IFN-γ mRNA 6 h与12 h、24 h间差异均有统计学意义(P<0.05)，但各时间点仍较SO组同时间点明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)(图6B-D)。

六、ANP组MUC2表达与肠道通透性、促炎细胞因子表达的关系

相关性分析显示，ANP组结肠组织MUC2 mRNA表达与血清D-乳酸水平和结肠组织TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表达均呈显著负相关(表2)。

表2ANP组结肠组织MUC2表达与肠道通透性、促炎细胞因子表达的关系(Spearman相关系数分析)

指标MUC2mRNAr值P值血清D⁃乳酸-0．790<0．05TNF⁃αmRNA-0．803<0．05IL⁃1βmRNA-0．619<0．05IFN⁃γmRNA-0．611<0．05

*两组间比较，P<0.05

*两组间比较，P<0.05

讨 论

急性胰腺炎是一种临床常见的急腹症，其中重度急性胰腺炎常伴有持续性器官功能衰竭，病死率高达20%～30%。ANP的进展与肠屏障功能障碍有密切联系，肠道通透性增加，肠道菌群易位，内毒素入血，加重ANP病情。研究显示肠屏障损伤程度与MODS的发生和死亡率呈显著正相关[4-5]。本研究以胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠建立ANP大鼠模型，发现模型动物血清D-乳酸水平随时间延长而逐渐增高，提示肠道通透性增加，同时结肠组织病理学改变逐渐加重，与Liang等[3]的发现一致。既往研究认为ANP合并肠屏障损伤与微循环障碍、缺血再灌注损伤、炎症介质过度释放等系统性因素有关[6]，但确切机制仍未明确。

肠道上皮表面的黏液层作为主要物理屏障，可隔绝肠道致病菌和有害物质与肠上皮细胞直接接触。肠黏液层的主要组成成分是由杯状细胞合成、分泌的黏蛋白MUC2。现有证据表明肠黏液层具有重要屏障作用，Muc2-/-小鼠肠道含黏液杯状细胞和肠腔内黏液层缺如，细菌直接接触肠上皮细胞甚至进入上皮细胞和隐窝内部，可发生自发性结肠炎甚至进展至结肠癌[9]。对活动期溃疡性结肠炎患者的研究[8]亦发现患者结肠活检标本中可观察到细菌穿透黏液层与上皮细胞接触，这一现象可能与含黏液杯状细胞和黏液产生减少有关[10]。有学者发现，在肠道缺血再灌注损伤中，肠黏液层状态与肠道通透性密切相关，黏液层不仅充当肠腔内容物与表面上皮之间的屏障，在肠屏障功能的维持和恢复中亦起有关键作用[11]。因此，肠黏液层对肠屏障功能的维护作用不可忽视。本研究通过PAS/AB染色观察到ANP大鼠结肠黏液层明显变薄甚至部分缺失，隐窝内含黏液杯状细胞数减少，上述改变随时间延长而加重，与结肠组织中的MUC2 mRNA表达变化相符。相关性分析显示，ANP大鼠结肠组织MUC2 mRNA表达与肠道通透性(血清D-乳酸水平)呈显著负相关。由此认为MUC2对ANP时的肠屏障损伤起重要保护作用。关于ANP时MUC2 mRNA表达下调是否是肠道通透性增加的原因之一，后续研究拟通过增加ANP造模后更早期的观察时间点，以及预先使用黏液耗竭剂加以证实。

研究[12]显示急性胰腺炎早期在肠道病理损伤前即已出现肠黏液层破坏或缺失以及肠道通透性增加，并发现这一现象可能与氧化应激有关，但具体机制不明。本研究检测了ANP大鼠结肠组织中的促炎细胞因子表达，发现TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表达均显著上调，6 h时即达到高峰，其后略有下降；相关性分析发现这些促炎细胞因子 mRNA表达均与MUC2 mRNA表达呈显著负相关。既往研究[13]显示TNF-α可通过激活JNK信号通路抑制MUC2基因转录，从而抑制MUC2蛋白表达。另有研究[14]发现在沙门菌感染肠炎小鼠中，黏蛋白降解可显著加重结肠损伤，上调结肠组织促炎细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6等)mRNA表达，分泌黏蛋白的杯状细胞数与IFN-γ mRNA表达呈显著负相关。上述发现和本研究结果均表明肠道促炎细胞因子与MUC2之间存在一定相关性，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究发现ANP大鼠结肠组织损伤明显，肠道通透性增加，肠黏液层变薄，含黏液杯状细胞数明显减少，MUC2 mRNA表达下调，并与肠道通透性增加和病程早期促炎细胞因子过度表达有关，表明杯状细胞分泌的MUC2可能参与了ANP时的肠屏障损伤。本研究的不足之处在于仅提示MUC2与肠道通透性和促炎细胞因子表达之间存在相关性，其中的具体机制和因果关系仍有待进一步研究。保护肠黏液层可能在一定程度上减轻肠屏障损伤，在临床治疗层面为改善重度急性胰腺炎的预后提供了新的策略。

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EffectofDown-regulatedMUC2TranscriptiononIntestinalPermeabilityinRatsWithAcuteNecrotizingPancreatitis

XUHui,ZHENGJunyuan,FANJunjie,HUANGChunlan,ZENGYue.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(201620)

Co-correspondencetoHUANG Chunlan, Email: huangchl@hotmail.com; ZENG Yue, Email: carrie@medmail.com.cn

Background: Acute pancreatitis can induce intestinal barrier dysfunction in its early phase, which is closely related with the progression and prognosis of the disease. Intestinal mucus layer not only serves as a physical barrier between pathogens and epithelium, but also plays a critical role in the maintenance of intestinal barrier function.AimsTo investigate the expression and role of mucin 2 (MUC2) in injured intestinal barrier in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups: the sham operation (SO) group and ANP group, which were induced via a retrograde injection of 3.5% sodium taurocholate into biliopancreatic duct. Blood, pancreas and colon samples were obtained 6, 12 and 24 hours after establishing the ANP model for determination of serum amylase and D-lactate (an indicator of intestinal permeability) and histopathological examination. PAS/AB staining was used to observe the colon mucus layer and goblet cells, and the expressions of MUC2 and inflammatory cytokines in colonic tissue were detected by real-time PCR.ResultsANP models were successfully established. In ANP group, obvious colonic injury, increased intestinal permeability, thinner colon mucus layer, reduced mucin-containing goblet cells, down-regulated MUC2 mRNA and up-regulated tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interferon-γ (IFN-γ) mRNAs were observed at each time point as compared with those in SO group (P<0.05). Spearman correlation coefficient revealed that MUC2 expression was negatively correlated with the intestinal permeability and expression of inflammatory cytokines in ANP group (P<0.05).ConclusionsTranscription of MUC2 is significantly down-regulated in colonic tissue of ANP rats, and might be associated with increased intestinal permeability and excessive expression of inflammatory cytokines in early phase of ANP.

Pancreatitis, Acute Necrotizing; Mucin-2; Goblet Cells; Intestinal Permeability

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.12.003

上海交通大学“医工交叉研究基金”面上项目(YG2015MS29)

#Email: xuhuijy@126.com

&本文共同通信作者：黄春兰，Email: huangchl@hotmail.com；曾悦，Email: carrie@medmail.com.cn

(2017-06-12收稿；2017-07-11修回)