响应面法优化微波辅助提取纯化大黄素的工艺研究

孙淑娟

（西安石油大学化学化工学院，陕西 西安 710065）

响应面法优化微波辅助提取纯化大黄素的工艺研究

孙淑娟

（西安石油大学化学化工学院，陕西 西安 710065）

以植物掌叶大黄的根茎粗粉为原料，采用微波辅助方法提取掌叶大黄根茎中的大黄素，研究了不同料液比、辐射功率、辐射时间和辐射温度对大黄素提取率的影响，通过响应面法对其工艺条件进行优化。结果表明，该工艺的最佳条件为：料液比1∶8 g/mL，辐射功率400 W，辐射时间40 min，辐射温度60℃，在此条件下，大黄素的平均提取率为0.598%，与预测值0.54%接近，这说明所建立的模型是切实可行的。

掌叶大黄；大黄素；微波辅助；响应面法

掌叶大黄为蓼科植物，味苦，性寒，根及根茎可入药，具有泻热通便，凉血解毒，逐瘀通经等功效。其有效成分为蒽醌衍生物，包括：大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚[1]。蒽醌类化合物大黄素可以防治肝功能损害，治疗心血管疾病等，具有较高的药理作用和保健价值[2]15958。科研人员已对大黄素的含量测定方法、提取、提纯工艺进行了研究，如王蓉等人介绍了超声-微波协同萃取何首乌中大黄素的最佳工艺条件，为后续的大黄素的提取提供参考[2]15959。杜永峰等人通过分光光度法测出了大黄中大黄素的含量[3]。微波辅助法提取具有反应高效性、强选择性等特点，且操作简便、副产物少、节省溶剂、产率高、安全清洁，已广泛用于天然产物的提取[4]。

本文采用微波辅助提取法，以有机溶剂无水乙醇为提取溶剂，从植物掌叶大黄根茎粗粉中提取大黄素，考察不同料液比、辐射功率、辐射时间和辐射温度对大黄素提取率的影响，并建立响应面实验优化工艺条件。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

材料：掌叶大黄的根茎，无水乙醇（分析纯）。

仪器：FW117中草药粉碎机，广州雷迈机械设备有限公司；WF-2000微波快速反应系统，上海屹尧分析仪器有限公司；SHZ-D循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；恒温水浴锅；DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱；GR-200电子天平，日本AND；EYEL4型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微波辅助提取大黄素的工艺流程

掌叶大黄的根茎洗净、烘干→粉碎过筛→准确称取→有机溶剂抽提→微波辅助提取→稀释定容→测定吸光度→计算提取率。

1.2.2 大黄素的提取

称掌叶大黄根茎洗净后，温度60℃下烘干，粉碎过80目筛，准确称取掌叶大黄根茎粉末10 g于锥形瓶中，加入10倍量的无水乙醇溶液，在辐射功率400 W，辐射时间40 min，辐射温度60℃，料液比1∶8 g/mL的条件下微波辅助提取，提取完成后，得到棕黄色透明滤液，蒸发挥干乙醇得提取大黄素，测定吸光度，计算提取率。

1.2.3 大黄素的纯化

精确称取经微波辅助提取得到的大黄素30 g于500 mL圆底烧瓶中，加12倍量的无水乙醇，置沸水浴中回流提取2 h，滤液静置 3 h，抽滤，得沉淀，洗涤沉淀3次，合并洗涤后的沉淀。取所得沉淀的1/10，加15倍量的乙酸乙酯溶解，用量浓度为5 mol/L氢氧化钠溶液萃取3次，将萃取液用量浓度为3 mol/L盐酸调至酸性，得橙黄色沉淀，用冰乙酸重结晶，最终纯化得大黄素产品。

1.2.4 标准曲线的绘制

精密称取纯化后的大黄素50 mg，溶解定容至500 mL容量瓶，加入一定量的无水乙醇溶解并定容至刻度线，配制成100 mg/L的标准溶液，以备用。

用移液管吸取标准溶液1.0 mL，移到10 mL容量瓶中，加入量浓度为5 mol/L的NaOH溶液1.0 mL，摇匀，乙醇定容，摇匀，放置10 min，用空白做对照。用UV-2550型紫外可见分光光度计于波长200～550 nm范围内测定其吸光度，结果表明：大黄素标准溶液在波长530 nm处达到最大吸光度，因而选用530 nm为测定波长。

另取50 mL容量瓶7个，分别加入已配制好的大黄素标准溶液， 依次加入 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 和 5.0 mL，加入1.0 mL量浓度为5 mol/L的NaOH溶液，用乙醇定容至50 mL，放置10 min，以空白溶液为参比，用紫外可见分光光度计在波长530 nm处测定其吸光度。以吸光度值A对质量浓度C进行线性回归，得到纯化大黄素的标准曲线图，如图1所示。其中，大黄素的线性回归方程计算为y=0.007 5x+0.022 8，相关系数R2=0.998，表明在测定范围内大黄素线性关系良好。

图1 纯化大黄素溶液的标准曲线

1.2.5 大黄素提取率的计算

式中：y为大黄素提取物的吸光度；Q为大黄素提取物的总稀释倍数。

1.2.6 溶剂的选择

大黄素属于蒽醌衍生物，不易溶于水，但易溶于一些有机溶剂和碱性溶液，如无水乙醇、氢氧化钠、乙酸、乙酸乙酯等溶剂，采用不同溶剂提取掌叶大黄根茎中的大黄素，结果如图2所示。

吸光度越高，提取效果越好。由图2可知，在所有实验的溶剂中，无水乙醇提取物的吸光度最高为0.68，其次为乙酸乙酯提取物，吸光度为0.6，其他几种均较低。因此本实验选用无水乙醇为提取溶剂。

图2 不同溶剂对大黄素的提取效果

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验

以大黄素的提取率为指标，分别研究料液比、辐射功率、辐射时间以及辐射温度对掌叶大黄根茎粉末提取率的影响，进而确定单因素的最佳工艺条件。

1.3.2 响应面实验

以单因素实验结果为依据，选择辐射功率、辐射时间、辐射温度为相应变量，以大黄素的提取率为响应值，采用Box-Behnken设计进行大黄素提纯工艺优化的响应面实验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对掌叶大黄根茎部大黄素提取率的影响

按照1.2.2的步骤进行实验。在辐射功率400 W，辐射时间40 min，辐射温度60℃的条件下，分别设定料液比 1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12 和 1∶14 g/mL进行实验，测定吸光度值，计算提取率，结果如图3所示。

图3 料液比对植物掌叶大黄中大黄素提取率的影响

从图3可知，随着溶剂含量的增加，植物掌叶大黄中大黄素的提取率是先增加后减小；当料液比为1∶8 g/mL时，大黄素的提取率达到最大，随着溶剂量的增加，植物掌叶大黄中大黄素的提取效率反而逐渐降低。这有可能是因为溶剂的量增多使得掌叶大黄中有其他物质生成，阻碍了大黄素的溶解。综合各个方面，选择最佳的料液比为1∶8 g/mL。

2.1.2 辐射时间对掌叶大黄根茎部大黄素提取率的影响

按照1.2.2的步骤进行实验，在辐射功率400 W，辐射温度60℃，料液比为1∶8 g/mL的条件下，分别设定辐射时间为 20、25、30、35、40 和 45 min 进行实验，测定其吸光度的值，并计算提取率，结果如图4所示。

图4 辐射时间对植物掌叶大黄中大黄素提取率的影响

由图4可知，随着辐射时间的不断增加，植物掌叶大黄中大黄素的提取率是先增大后减小，辐射时间为40 min时，对应的吸光度最大，大黄素的提取率也最高，再延长辐射时间时，大黄素的提取率反而下降。这有可能是辐射时间过长，微波辐射会损坏大黄素的结构，使得提取率降低，因此最佳的辐射时间为40 min。

2.1.3 辐射功率对掌叶大黄根茎部大黄素提取率的影响

按照1.2.2的步骤进行实验。在辐射时间40 min，辐射温度60℃，料液比为1∶8 g/mL的条件下，分别设定辐射功率为 100、200、300、400、500 和 600 W进行实验，测定吸光度值，计算提取率。结果如图5所示。

由图5可知，随着辐射功率逐渐增加，植物掌叶大黄中大黄素的提取率是先增大后减小，当辐射功率为400 W时，大黄素的提取率最高，随着辐射功率的再增加，提取率反而降低。由此看出，随着辐射功率的增大，植物掌叶大黄中的大黄素会逐渐溶解在无水乙醇中，但功率过大可能会使一部分的大黄素结构发生变化，故选择400 W为提取大黄素的最佳辐射功率。

2.1.4 辐射温度对掌叶大黄根茎部大黄素提取率的影响

按照1.2.2的步骤进行实验。在辐射时间40 min，辐射功率为400 W，料液比为1∶8 g/mL的条件下，分别设定辐射温度为 30、40、50、60、70 和 80 ℃进行实验，测定吸光度值，计算提取率。结果如图6所示。

图5 辐射功率对植物掌叶大黄中大黄素提取率的影响

图6 辐射温度对植物掌叶大黄中大黄素提取率的影响

由图6可知，大黄素的提取率随温度的升高先增大后减小，当辐射温度为60℃左右时，大黄素的提取率最大，再提高辐射温度时提取率反而降低，因而，最佳的辐射温度是60℃。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面模型的建立及其显著性

以单因素实验结果为依据，选择辐射功率、辐射时间、辐射温度为相应变量，以大黄素的提取率为响应值，进行响应面实验，实验因素水平及编码如表1所示，响应面实验设计及测定结果见表2。

表1 响应面实验因素水平及编码表

采用Design-Expert.8.0.6.1软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得到响应值大黄素的提取率（Y）对因素自变量辐射功率（A）、辐射时间（B）和辐射温度（C）的二次多项式回归模型方程为：

在回归模型方程中，正系数表明变量的正向变化将会引起响应值的增加，负的二次项系数表明抛物线开口向下，该方程有极大值，可以进行最优分析。对回归方程进行方差分析，结果见表3（其中，**表示P＜0.01，达到差异极显著水平）。

表2 响应面实验设计及测定结果

表3 回归模型方程方差分析

由表3可知，该模型显著（显著水平P=0.0020＜0.05），而失拟项（P失拟=0.0892＞0.05）不显著，残差是由随机误差引起的，说明该模型相关度较高，模型拟合可靠。

回归方程一次项回归系数的绝对值大小关系为：C＞A＞B，则3个因素对大黄素提取率影响的大小依次为：辐射温度＞辐射功率＞辐射时间。

2.2.2 响应面分析与优化

采用Design-Expert.8.0.6.1软件对因素绘制响应面三维图，所拟合的响应面形状反映了辐射功率（A）、辐射时间（B）和辐射温度（C）这 3个因素的两两交互作用对大黄素提取率的影响，响应面三维图和等高线如图7、图8和图9所示。

由图7可知，辐射功率（A）和辐射时间（B）2个因素的交互作用并不显著。由响应面可以看出，当辐射功率不变时，随着辐射时间的增加，大黄素提取率先升高后降低；而当辐射时间不变时，随着辐射功率的提高，大黄素的提取率先升高后降低。

图7 辐射功率（A）和辐射时间（B）对大黄素提取率影响的响应面图

图8 辐射时间（B）和辐射温度（C）对大黄素提取率影响的响应面图

图9 辐射功率（A）和辐射温度（C）对大黄素提取率影响的响应面图

由图8可知，辐射时间（B）和辐射温度（C）2个因素交互作用并不显著。由响应面图可以看出，当辐射时间不变时，随着辐射温度的增大，大黄素提取率先升高后降低，而当辐射温度不变时，随着辐射时间的增大，大黄素提取率先升高后降低。

由图 9可知，辐射功率（A）和辐射温度（C）2个因素交互作用并不显著。由响应面图可以看出，当辐射功率不变时，随着辐射温度的增加，大黄素提取率先升高后降低。而当辐射温度不变时，随着辐射功率的增大，大黄素提取率先升高后降低。

综上所述：3个因素A、B、C的两两交互作用均不显著，这与回归方程方差分析结果一致。由此可得大黄素提取的最佳条件为：辐射功率为409 W，辐射时间为44 min，辐射温度为55℃，植物掌叶大黄中大黄素提取率的预测值为0.54%。

2.2.3 回归模型的验证

通过上述回归模型，对最佳条件进行修正，最终结果为：辐射功率400 W，辐射时间40 min，辐射温度60℃。在该条件下进行3次平行实验，实际测得大黄素提取率平均值为0.598%，与理论值0.54%差异较小，故采用响应面法优化得到的植物掌叶大黄中大黄素提取条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论

响应面实验结果表明，影响大黄素提取率的主次因素依次为：辐射温度＞辐射功率＞辐射时间；大黄素提取的最佳工艺条件为：料液比1∶8 g/mL，辐射功率400 W，辐射时间40 min，辐射温度60℃。此条件下，大黄素的平均提取率为0.598%，与预测值0.54%接近，这说明响应面法优化的回归模型是可行的，预测能力良好。

[1] 徐庆，覃永俊，苏小建，等.掌叶大黄化学成分研究[J].中草药，2009，40（4）：533-536.

[2] 王蓉，付大友，邹时英.超声-微波协同萃取何首乌中大黄素的工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39（26）.

[3] 杜永峰，许丽梅，姚秉华.分光光度法测定大黄中大黄素的含量[J]. 化学分析计量，2007，16（6）：43-45.

[4] 马稳，李鸿雁.微波辅助提取芦荟中芦荟大黄素工艺的研究[J].食品工业科技，2009，3007（7）:253-256.

10.13752/j.issn.1007-2217.2017.04.005

2017-07-25