废次烟叶多糖绿色提取工艺的研究

孙高军, 洪深求, 周小兵, 方红美, 章俊鹏, 周存六

(1.安徽省烟草质量监督检测站,安徽 合肥 230009; 2.合肥工业大学 食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009)

废次烟叶多糖绿色提取工艺的研究

孙高军1, 洪深求1, 周小兵1, 方红美2, 章俊鹏2, 周存六2

(1.安徽省烟草质量监督检测站,安徽 合肥 230009; 2.合肥工业大学 食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009)

废次烟叶富含多糖具有十分重要的开发价值。文章研究了热水浸提烟叶多糖的提取工艺,考察浸提料液比、时间、温度和浸提剂乙醇体积分数对烟叶多糖提取率的影响,在其基础上进行正交试验。结果表明，影响热水浸提烟叶多糖提取率的主次因素依次为浸提剂乙醇体积分数、温度、料液比、浸提时间。热水浸提烟叶多糖的最优组合条件为:浸提剂为蒸馏水,温度为80 ℃,料液比为1∶60,时间为30 min。上述条件下连续提取2次,多糖提取率可达4.08%。在该工艺条件下,烟叶多糖的提取率与微波提取法相当。该工艺不涉及微波、超声波等辅助设备和有机溶剂的使用,具有操作方便、成本低、环保等优势。

废次烟叶;多糖;绿色提取;工艺研究

植物多糖是一类由醛糖或酮糖通过缩合而成的、具有多种生物活性功能的天然高分子聚合物[1-2],在药品、食品以及精细化工品等方面具有广泛的应用前景[3-4]。植物多糖的提取与纯化、生物活性及其应用已成为近年来的研究热点之一[5]。

据统计,我国每年烟叶产量约450～500万吨,在烟叶采摘、加工过程中,将产生30%以上的烟叶、烟末和烟梗等下脚料[6-7]。这些废次烟叶富含多糖,是植物多糖的重要来源。目前主要采用超声波[7-9]、微波[10]、醇提[10]等技术手段提高废次烟叶多糖的提取率，但超声波、微波等难以实现连续化生产,醇提方法存在环保和成本高等问题。鉴于上述原因,我国废次烟叶尚未得到有效利用,大部分被废弃,造成资源的重大浪费与环境的严重污染。开发绿色、有效的多糖提取方法是提高废次烟叶综合利用的一个重要途径。

针对上述问题,本文探索了热水浸提烟叶多糖的工艺条件,可为废次烟叶资源的绿色开发利用提供技术支持和理论指导,并且该工艺条件可延伸到过剩烟叶的应用上,为过剩烟叶谋求新的综合利用途径提供思路。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

废次烟叶、无水乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、活性炭。所有试剂均为分析纯。

1.2 烟叶多糖提取方法

取1 g烟叶粉末放入烧杯中,按一定的液料比,加入一定体积和温度的蒸馏水,在设定的浸提剂乙醇体积分数、浸提时间和浸提温度条件下进行提取。提取结束后,在8 000 r/min、 4 ℃条件下离心15 min,取上清液,于65 ℃旋转蒸发,浓缩至体积的1/5。取浓缩液,加入体积为浓缩液4倍的无水乙醇,于4 ℃醇析过夜。再经5 000 r/min离心15 min,取多糖沉淀。多糖沉淀再次用蒸馏水溶解,随后采用Sevage法脱蛋白。

Sevage 法脱蛋白[11]。取上述烟叶多糖溶液溶于1/3体积氯仿和正丁醇的混合液(氯仿与正丁醇的体积比为 5∶1),磁力搅拌 30 min离心,取上层水相;重复上述操作,直到两相间无明显的蛋白沉淀为止。水相溶液即为烟叶粗多糖溶液。

1.3 热水浸提法提取烟叶多糖的的试验方案

(1) 料液比(A)。取1 g烟叶,料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,在60 ℃下浸提30 min,研究料液比对烟叶多糖提取率的影响。

(2) 时间(B)。取1 g烟叶,料液比为1∶20,在60 ℃下分别热水浸提20、30、40、50、60 min,研究浸提时间对烟叶多糖提取率的影响。

(3) 温度(C)。取1 g烟叶,料液比为1∶20,分别在40、50、60、70、80 ℃下浸提30 min,研究浸提温度对烟叶多糖提取率的影响。

(4) 浸提剂乙醇体积分数(D)。取1 g烟叶,料液比为1∶20,乙醇体积分数分别为0%、15%、30%、45%、60%,在60 ℃下浸提30 min,研究浸提剂乙醇体积分数对烟叶多糖提取率的影响。

根据单因素试验结果,选择A、B、C、D 4个因素进行L9(34)正交试验。

1.4 热水浸提次数对烟叶多糖提取率的影响

根据正交试验结果,在最优条件下对废次烟叶进行2次萃取,分别测定每次烟叶多糖的提取率,分析浸提次数对烟叶多糖提取率的影响。

1.5 微波辅助提取法与热水浸提法的比较

比较最优条件下热水浸提法与微波辅助提取法的烟叶多糖提取率。根据试验结果,选择的微波辅助提取条件为:微波功率450 W,时间40 min,料液比1∶20,温度70 ℃。

1.6 多糖质量浓度的测定

采用苯酚硫酸法[7]测定多糖的质量浓度。

(1) 制作标准曲线。准确称取葡萄糖标准品10 mg放入烧杯中溶解,转移到250 mL容量瓶中,用蒸馏水定容。分别吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于试管中,加蒸馏水补至1.0 mL,然后再加入5%苯酚0.5 mL及浓硫酸5.0 mL,在漩涡振荡器上震荡均匀,放入沸水浴中,保温15 min后取出,再放入水浴中冷却15 min。以加入0 mL萄糖标准液的反应液作为空白对照调零,于490 nm下测各反应液的吸光度值并记录。横坐标为葡萄糖质量浓度,纵坐标为吸光度值,以此绘制标准曲线。

(2) 烟叶多糖提取率的计算。取1 mL脱蛋白后所得的烟叶多糖溶液,稀释一定倍数。取3 mL稀释后溶液于试管中,分别加入0.5 mL 5%的苯酚和5 mL浓硫酸,余下操作同制作标准曲线的方法。测定并记录反应液在490 nm的吸光度值,测3次,取平均值,并通过标准曲线的公式反推其相应的烟叶多糖提取率。

根据所得糖标准曲线,由苯酚-硫酸法测定多糖溶液的吸光度A,可以计算出反应液中多糖的质量浓度ρ。然后由下式计算烟叶多糖的提取率，即

K=(ρnV/m)×100%,

其中,K为多糖提取率;ρ为反应液中多糖质量浓度;N为多糖浸提剂的稀释倍数;V为多糖浸提剂的体积;m为所用烟叶质量。

1.7 数据分析

用Excel 程序计算出平均值及相应的标准差,结果以(均值±标准差)表示;单因素试验数据间的显著性采用t检验计算,P<0.05为显著。

2 结果与分析

根据1.6的实验方法,以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线如图1所示,吸光度与葡萄糖质量浓度呈线性关系,线性方程为y=7.427 8x+0.006 6,R2=0.990 6。以此作为标准曲线,可计算烟叶多糖的提取率。

图1 葡萄糖标准曲线

2.1 热水浸提法单因素试验结果

2.1.1 浸提料液比对烟叶多糖提取率的影响

浸提料液比对烟叶多糖提取率的影响如图2所示。

图2 浸提料液比对烟叶多糖提取率的影响

由图2可以看出,料液比低于1∶50时,随着料液比的增加,烟叶多糖的提取率显著增加(P<0.05);在料液比为1∶50时,提取率达到最大值;料液比超过1∶50时,随着料液比的增加,烟叶多糖的提取率显著下降(P<0.05)。可能是由于料液比太小时,烟叶多糖不能充分溶解,导致提取率低;随着料液比的增加,烟叶充分溶胀,利于多糖的溶出,提取率增加。

2.1.2 时间对烟叶多糖提取率的影响

时间对烟叶多糖提取率的影响如图3所示,由图3可看出,随浸提时间的增加,烟叶多糖的提取率总体呈现先增加后减小的趋势,在40 min时,提取率显著增加(P<0.05)达到最大值。提取过程本质上是原料中的被提取物溶解于浸提剂的过程;该过程中被提取物必须与浸提剂接触并发生作用。因此,浸提剂渗透至原料的内部以及被提取物在浸提剂中溶解达到平衡需要一定的时间。这可能是在小于40 min内烟叶多糖的提取率随着浸提时间的延长而增加的缘故。另一方面,当浸提时间进一步延长,一些其他水溶性成分也可能被萃取出来,这些成分与烟叶多糖竞相与水分子作用,导致烟叶多糖溶解度的下降,从而导致多糖提取率的降低。

图3 浸提时间对烟叶多糖提取率的影响

2.1.3 温度对烟叶多糖提取率的影响

温度对烟叶多糖提取率的影响如图4所示。

图4 浸提温度对烟叶多糖提取率的影响

由图4可看出,在低于60 ℃时,随温度的升高、烟叶多糖提取率的变化不大(P>0.05);与60 ℃时相比，70 ℃时烟叶多糖的提取率有显著的提高(P<0.05)；与60 ℃时相比，提取温度为80 ℃时,烟叶多糖的提取率无明显变化(P>0.05)。通常,提取温度的升高可能加剧多糖分子的运动、提高多糖的溶解速度,缩短未溶解多糖与多糖溶液之间的平衡时间[12];多糖溶解通常也是一个吸热过程,温度升高将推动多糖溶解的方向移动,有利于多糖分子的溶出,从而提高了多糖的提取率[13]。

2.1.4 乙醇体积分数对烟叶多糖提取率的影响

多糖是一类多羟基醛酮类化合物[14],研究者根据相似相溶原理选用极性有机溶剂(如乙醇等)作为多糖复合浸提剂的组分,以提高多糖的提取率[10]。乙醇体积分数对烟叶多糖提取率的影响如图5所示,由图5看出,在乙醇体积分数达到15%之前,提取率略有增加(P>0.05);然而,随着萃取剂中乙醇体积分数的进一步提高,烟叶多糖的提取率呈逐渐下降趋势;与纯水作为参照,萃取剂中乙醇体积分数达到60%、烟叶多糖的提取率明显下降(P<0.05)。上述结果表明,萃取剂中引入乙醇可能导致多糖在水中溶解度的降低,不利于烟叶多糖的提取。一些文献也报道采用乙醇沉降法提纯多糖[7],就是利用向多糖溶液中加入乙醇降低多糖溶解度的原理。由此推测,以纯水作为萃取剂可能更有利于烟叶多糖的萃取。

图5 浸提剂乙醇体积分数对烟叶多糖提取率的影响

2.2 热水浸提烟叶多糖的正交试验结果

依据单因素实验的结果,选择A、B、C、D 4个因素、每个因素3个水平,按照L9(34)进行正交试验。正交试验结果见表1所列。

由表1可得,影响热水浸提烟叶多糖提取率的因素主次顺序为D>C>A>B,即浸提剂乙醇体积分数影响最大,其次是浸提温度和料液比,浸提时间影响最小。从极差分析看,热水浸提烟叶多糖的最优组合条件为A3B1C3D1,即蒸馏水浸提温度为80 ℃,料液比为1∶60,时间为30 min。而直观分析所得最好结果为第3组试验,最优条件为A3B3C3D1,即蒸馏水浸提温度为80 ℃,料液比为1∶60,时间为50 min。因此,需要进行验证实验,才能确定热水浸提烟叶多糖的最优条件。

验证试验结果表明,按照实验条件A3B1C3D1进行萃取,多糖的提取率为3.67%,而按照A3B3C3D1试验条件进行萃取,多糖的提取率为3.31%，因此,热水浸提烟叶多糖的最优条件为A3B1C3D1。

表1 热水浸提法提取烟叶多糖的正交试验结果

热水浸提法是植物多糖提取的重要方法之一。但由于多糖定量分析未考虑色素、蛋白等杂质的干扰,与文献报道的实验结果大相径庭、缺乏可信度[7，10]。本文以纯化多糖产率为依据,研究确定热水浸提烟叶多糖提取的影响因素和合适工艺条件。由于排除色素、蛋白等杂质对多糖定量分析的干扰,试验结果更加真实可信。

另外,正交试验结果还表明，与乙醇水溶液相比,纯水更有利于烟叶多糖的提取,证实了前面的推测。这为纯水作为烟叶多糖萃取剂提供了试验依据。相比于以乙醇等有机水溶液复合萃取剂,纯水作为萃取剂成本低、更环保。

2.3 浸提次数对多糖提取率的影响

浸提次数也是影响多糖提取率的重要因素之一。前面的试验未考虑该因素对多糖提取率的影响，因此,有必要考察浸提次数对烟叶多糖的提取率影响。结果表明:第1次浸提多糖提取率为3.67%,第2次浸提多糖提取率为0.41%,2次浸提多糖总提取率达4.08%。比第1次浸提、第2次浸提的多糖提取率提高了11.1%，因此有必要进行二次浸提。

2.4 微波辅助提取法与热水浸提法的比较

微波、超声波是近年来发展起来的新兴技术,分别利用微波能[10]、超声波的机械效应、空化效应和热效应来增大介质的运动速度和穿透力从而提高提取率[12],已广泛用于食品加工、天然产物提取等领域[10,12,15]。为了评价热水浸提法对烟叶多糖提取效率,对最优条件下热水浸提法与微波辅助提取法的烟叶多糖提取率进行比较,结果表明:热水浸提法的提取率为(3.62±0.10)%,微波提取法的提取率为(4.75±0.12)%,效果稍优于热水浸提法,但两者没有显著差异(P>0.05)。微波辅助提取法操作复杂、难以实现连续化生产,且设备成本高[10],难以实现工业化生产。因此,从工业化生产来讲,更适宜采用热水浸提法。

3 结 论

影响热水浸提烟叶多糖提取率的主次因素为浸提剂乙醇体积分数、浸提温度、料液比、浸提时间。热水浸提烟叶多糖的最优工艺条件为:用纯水浸提,温度为80 ℃,料液比为1∶60,时间为30 min。上述条件下连续提取2次,多糖总提取率可达4.08%。在该工艺条件下,烟叶多糖的提取率与微波提取法相当。本工艺不需要微波、超声波辅助设备,不涉及有机溶剂的使用和pH值调节工序,因而具有绿色、操作方便、成本低等优势。

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Studyofgreenextractiontechnologyofpolysaccharidesfromwastetobaccoleaves

SUN Gaojun1, HONG Shenqiu1, ZHOU Xiaobing1, FANG Hongmei2, ZHANG Junpeng2, ZHOU Cunliu2

(1.Anhui Tobacco Quality Supervision and Test Station， Hefei 230009， China; 2.School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology, Hefei 230009， China)

Waste tobacco leaves， which are rich in polysaccharides， have very fundamental development value. In this paper, the extraction technology of polysaccharides from tobacco leaves by hot water extraction was studied, the effect of the ratio of raw tobacco to extraction medium， time， temperature and ethanol concentration of extraction medium on polysaccharides yield was investigated, and then the orthogonal test was conducted. The results showed that the importance for polysaccharides yield decreased in the following order： ethanol concentration of extraction medium， extraction temperature， ratio of raw tobacco to extraction medium and extraction time. The optimum conditions for polysaccharides extraction were established as follows：the extraction medium was distilled water， the extraction temperature was 80 °C， the ratio of raw tobacco to extraction medium was 1∶60 and the extraction time was 30 min. The total polysaccharides yield of twice extraction was up to 4.08% under the presented conditions， which was similar to that under microwave-assisted extraction. This process does not involve in the use of microwave or ultrasonic equipment and organic solvent. So it has the advantages of convenient operation， low cost and environment-friendliness.

waste tobacco leaf; polysaccharide; green extraction; process research

2016-04-29；

2016-09-01

安徽省烟草公司重点资助项目(20150551001);安徽省省级大学生创新资助项目(2015CXCYS080)

孙高军(1979-),男,安徽巢湖人,博士,安徽省烟草质量监督检测站高级工程师；

周存六(1970-),男,安徽舒城人,博士，合肥工业大学教授,硕士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.12.023

Q539

A

1003-5060(2017)12-1704-05

(责任编辑闫杏丽)