拟南芥转录因子Ethylene-insensitive3(EIN3)抑制花青素的合成

徐梦珂 李 丹 孟来生* 蒋继宏

(1.江苏省药食植物生物技术国家重点实验室培育点，徐州 221116； 2.江苏师范大学生命科学学院，徐州 221116)

拟南芥转录因子Ethylene-insensitive3(EIN3)抑制花青素的合成

徐梦珂1,2李 丹1,2孟来生1,2*蒋继宏1,2

(1.江苏省药食植物生物技术国家重点实验室培育点，徐州 221116；2.江苏师范大学生命科学学院，徐州 221116)

Ethylene-insensitive3(EIN3)和 EIN3-like1(EIL1)蛋白是乙烯信号转导途径中一类重要的核转录因子。花青素是植物体中的一类水溶性天然色素，在植物的许多生理过程中起重要作用。本研究以拟南芥双突变体ein3-1eil1-3为研究材料，通过RT-PCR技术确定了拟南芥双突变体ein3-1eil1-3中EIN3和EIL1基因均已被敲除，单突变体ein3-1中的EIN3基因被敲除。通过肉眼定性观察发现突变体ein3-1eil1-3的种子和叶片内均呈紫色。通过紫外分光光度计定量分析发现，花青素积累量也明显比突变体ein3-1和野生型多。通过GUS染色发现EIN3启动子主要在花、柱头、成熟花粉、种子胚和果荚等组织中有较强的表达。这与突变体ein3-1eil1-3的种子和叶片内均呈紫色并花青素含量增高一致。因此，拟南芥转录因子EIN3可能与EIL1共同参与抑制花青素的合成。

Ethylene-insensitive3(EIN3)；Ethylene-insensitive3-like 1(EIL1)；花青素；拟南芥

花青素属于黄酮类化合物，是植物体中的一类水溶性天然色素。花青素在植物的许多生理过程中起重要作用，例如可以在植物的营养组织中产生光保护屏障，是授粉和种子传播中的视觉吸引子，并且可以作为防御反应中的抗菌剂和拒食剂[1]。植物表皮细胞的液泡中可以大量储存花青素，有利于降低植物细胞的冰点，防止植物体受低温胁迫[2～3]。因此，对花青素的研究具有重要意义。

目前，植物中的花青素生物合成途径已得到深入研究。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)和其他一些非模式植物例如金鱼草(AntirrhinummajusL.)和矮牵牛(Petuniahybrida)等中，如查耳酮合酶，查耳酮异构酶(CHI)，黄烷酮3-羟化酶和类黄酮3′-羟化酶(F3′H)[4]等在不同的类黄酮素子通路中十分常见的早期生物合成基因(EBGs)会被二氢黄酮醇4-还原酶，无花色素加成酶，花青素还原酶[5]和UDP葡萄糖，类黄酮3-O葡糖基转移酶等后期生物合成基因(LBGs)诱导[6～7]。在拟南芥[8]中发现，形成亚微管的细胞隔室可以积聚大量的花青素[9]。发现拟南芥TT19可作为载体将花青素从细胞质中转移到叶绿体中。最近孟[10～11]等发现拟南芥转录共激活子AN3(ANGUSTIFOLIA3)是花青素生物合成的正向调控因子，an3敲除突变体种子叶片等器官上花青素含量明显减少。AN3的下游靶标基因是YODA,它编码MAPKKK激酶，YODA也是新发现的花青素生物合成的负向调控因子[11]。AN3和YODA构成糖信号转导通路调控花青素的生物合成[11]。此外，AN3与COP1(Constitutive Photomorphogenic1)，编码一个泛素化酶，构成光信号转导通路调控花青素的生物合成[10]。

Ethylene-insensitive3(EIN3)和EIN3-like(EIL)蛋白是乙烯信号转导途径中一类重要的核转录因子。乙烯是一种经典的植物激素，影响着植物生长发育的许多进程。目前已经从多种高等植物中分离得到EIN3基因，包括水稻、拟南芥和烟草等。EIN3是植物特异性核转录因子，可以启动乙烯应答的下游转录级联反应[12]。葡萄糖通过植物葡萄糖传感器己糖激酶(HXK1)增强其降解，并且乙烯可以增强其稳定性[12]。拟南芥基因组中有5个EIN3同源物(EIL1至EIL5)，其中EIN3和EIL1是最密切相关的。EIL1的过表达补充了ein3突变体，并导致乙烯反应途径的组成型激活[13]。而ein3eil1双突变体表现对乙烯不敏感[14]，说明二者在乙烯信号转导中发挥了重要作用。据报道，EIN3/EILs转录因子可以影响乙烯诱导的叶片和根系等的生长进程：拟南芥ein3突变体的莲座叶生长受阻和叶片衰老表型在外源乙烯的作用下均得到一定程度的缓解[13]，而ein3eil1双突变体的子叶的绿化率则明显减弱[15]；EIN3/EILs转录因子还影响花的形态发育，[15]研究发现过量表达EIN3、EIL1的拟南芥植株会有雌蕊突出的表型[16]，Yin X R[17]、Hiraga S[18]等也发现EIN3参与抗盐，抗冻，抗机械伤胁迫等的功能。EIN3也参与调控叶片衰老和抗冻等[19～20]。而目前关于EIN3是否参与调控花青素合成的研究较少。

在本研究中，我们以拟南芥双突变体ein3-1eil1-3为研究材料，定性和定量分析显示，与野生型和ein3-1单突变体相比，这个双突变体花青素积累量明显增加。进一步，利用GUS染色发现EIN3启动子(EIN3pro-GUS)主要在花、柱头、成熟花粉、种子胚和果荚等组织中有较强的表达。EIN3在这些器官中表达支持了花青素在ein3-1eil1-3的几种器官中积累。该研究结果初步说明拟南芥转录因子EIN3可能与EIL1共同参与负调控花青素的合成，为完善花青素合成的分子调控机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 植物材料

本研究所用到的拟南芥材料均为哥伦比亚(Columbia)生态型背景，有拟南芥野生型Col-0；突变体ein3-1eil1-3由南方科技大学郭红卫教授提供；突变体ein3-1由拟南芥生物研究中心(ABRC)(俄亥俄州立大学，俄亥俄州哥伦布市)提供。

1.1.2 实验试剂

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒；AMV第一链cDNA合成试剂盒；PCR(Taq)扩增试剂盒。以上试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 植物生长条件

将种子在4℃下放置3天，然后播种到固体Murashige和Skoog(MS)培养基上，该培养基含有0.8%琼脂和1%蔗糖，pH5.8。将播撒种子的培养基放置在21±2℃，16 h/8 h的光/黑暗循环的培养室中。两周后将培养基中的幼苗移栽于土盆中，置于上述同等条件的培养室中继续培养。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计

TUB4：F：5′-GACGCTTCATCTCGTCC-3′；R：5′-GTAAACGTAGGTGAGTCCA-3′，基因登陆号为：AT5G44340。

EIN3：F：5′-ATGTTTAATGAGATGGGAAT-3′；R：5′-CTGCTTCTGCTGCATTCCATC-3′。

EIL1：F：5′-TTCCTCCACATCTCTCGATGT-3′；R：5′-CCTTCTCGGAATAATACCATAA-3′)。

1.3.2 RT-PCR

通过Trizol试剂从拟南芥叶片组织中提取总RNA。使用AMV第一链cDNA合成试剂盒对总RNA样品进行逆转录产生cDNA样品，并将其用作基于RT-PCR的基因表达分析的模板。

1.3.3 花青素含量的测定

将相对样品放置于500 mL的1% HCl的甲醇溶液(v/v)中，然后在4℃，黑暗，温和震荡的条件下过夜培养获得花青素提取物。在该过程之后，加入300 mL水和300 mL氯仿并混合到提取物中，12 000 r·min-1离心2 min，2900×g离心2 min。在530和657 nm下测量上清液的吸光度，通过A530-0.25A657公式测定花青素浓度[21～22]。

1.3.4 载体构建

通过启动子分析，插入0.5 kB的启动子片段构建EIN3(At3G20770)启动子-GUS载体，扩增引物为(P1-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct AACAAATGTGTC GAAGAACGTG，P2-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt AGATCAGGAAGATAGATCATAG)。这些片段被扩构建到pCB308R质粒上[23]，载体如图1所示。之后通过农杆菌转化野生型拟南芥，转基因植物通过抗生素卡那筛选，从而获得含有EIN3pro-GUS的转基因植株，并通过多代筛选获得含有EIN3pro-GUS的纯合体种子，供GUS测试用。

图1 pCB308R质粒载体示意图Fig.1 Vector diagram of plasmid pCB308R

1.3.5 GUS测定

样品(携带并表达EIN3pro-GUS的转基因拟南芥植株的花，胚胎等)在1 mmol·L-1X-gluc，60 mmol·L-1NaPO4缓冲液，0.4 mmol·L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1%(v)Triton X-100的溶液中染色，接着37℃培养6～8 h。然后在30%,50%,70%,90%和100%梯度浓度的乙醇中浸泡约10 min去除叶绿素。最后，使用HIROX三维视频显微镜在相关放大倍数下拍摄材料。

1.3.6 观察种子和叶片

使用HIROX三维视频显微镜拍摄成熟的干种子和新鲜叶片的叶背部分。

2 实验结果

2.1 RT-PCR结果分析

根据方法1.3.1使用持家基因TUB4引物和被测试基因EIN3，EIL1的引物对突变体ein3-1eil1-3，ein3-1和野生型(Col-0)进行RT-PCR分析验证。由图1可知通过RT-PCR实验证实了拟南芥双突变体ein3-1eil1-3中EIN3和EIL1基因均已被敲除，突变体ein3-1中的EIN3基因已被敲除。

图2 RT-PCR检测EIN3和EIL1基因的缺失 M. Marker；1.野生型；2.突变体ein3-1；3.突变体ein3-1eil1-3Fig.2 Detection of EIN3 and EIL1 gene deletion by RT-PCR M. Marker; 1.Col-0; 2.Mutant ein3-1; 3.Mutant ein3-1eil1-3

2.2 突变体ein3-1eil1-3的种子和幼苗叶片中花青素积累量增加

通过在HIROX三维视频显微镜下，观察突变体ein3-1eil1-3，ein3-1和野生型(Col-0)拟南芥成熟的干种子，发现在突变体ein3-1eil1-3中有部分种子颜色较深，但并没有在突变体ein3-1和野生型中发现这种现象(图3:A～C)。同时又观察了15天龄的拟南芥幼苗的叶片，发现也只有突变体ein3-1eil1-3的叶片呈紫色(图3:D～F)。定性观察显示，ein3-1eil1-3很可能积累了大量花青素。为了进一步验证这个结论是否正确，我们用紫外分光光度计对双突变体的叶片进行定量测定，发现突变体ein3-1eil1-3比突变体ein3-1和野生型幼苗的花青素积累量显著增高(图4)。这些数据表明EIN3和EIL1可能共同参与反向调节花青素的生物合成。

图3 突变体ein3-1eil1-3的种子和幼苗叶片在白光(16 h光/8 h黑暗)下生长时，花青素积累量增加 A～C.突变体ein3-1eil1-3，ein3-1和野生型(Col-0)拟南芥成熟的干种子；D～F. 15 d龄的突变体ein3-1eil1-3，ein3-1，野生型(Col-0)拟南芥幼苗叶片的叶背部分 材料来自至少5个以上独立传播的植株，放大倍率相同。Fig.3 ein3-1eil1-3 seeds and seedlings leaves had increase anthocyanin accumulation when grown under white light(16 h of light/8 h of darkness) A-C. Representative mature dry seeds ein3-1eil1-3,ein3-1,wild-type(Col-0); D-F. Representative seedlings leaves ein3-1eil1-3,ein3-1,wild-type(Col-0) Materials were from at least five independently propagated lines,magnifications are the same.

图4 柱状图显示了15天龄的突变体ein3-1eil1-3，ein3-1，野生型(Col-0)拟南芥幼苗之间的花青素积累量的差异 材料来自至少五个以上独立传播的植株，野生型花青素含量指定为1.0(n>10;*为P<0.05)。Fig.4 Bar graph exhibiting the difference in the anthocyanin accumulation between the 15-day-old ein3-1eil1-3,ein3-1,wild-type(Col-0) And wild-type is set as 1.0;Error bars represent SD(n>10);Heteroscedastic t-test analysis showed significant differences(*is P<0.05).

2.3 EIN3的表达分析

既然花青素能够在双突变体ein3-1eil1-3种子上和叶片上积累，那么，EIN3是否在这些组织中表达。以大约0.5 kB的EIN3启动子和GUS报告基因融合(EIN3pro-GUS)转化的转基因拟南芥作为材料进行GUS组织化学染色，检测EIN3启动子的表达，实验结果表明EIN3启动子主要在花、柱头、成熟花粉、种子胚和果荚等生殖器官组织中有较强的表达(图5)，这个结论证明了我们以上的推测。

3 讨论

Rabino I[21]发现一些环境因子如光照、温度，和Shan X[24]发现的茉莉酸甲酯以及Deikman J[25]发现的细胞分裂素均可以通过调控花青素合成途径中结构基因的表达水平变化，以此改变拟南芥植物细胞中花青素含量的累积。近几年来，人们发现了植物体内一些转录因子也可以调控花青素的生物合成，并且这种调控作用是多种因子共同作用的结果。Ramsay N A[26]研究表明，调控花青素生物合成途径的转录因子主要包括3个基因家族,即MYB、bHLH和WD40家族。大部分的转录因子是通过转录激活调控来发挥功能。在拟南芥中，Borevitz J O等[27]研究发现与花色相关的重要转录因子PAP1和PAP2，是一大类正调控因子。而目前只在拟南芥中发现ICX1是CHS表达的负调控因子[28]，AtMYB4是R2R3-MYB的转录抑制因子[29]，MYB的负调控因子MYBL2、MYB4[30]以及Pauwels L等[31]在2011年发现的JAZ(Jasmonate-ZIM Domain)蛋白可以作用于MBW三聚体复合物，从而抑制花青素合成。植物激素茉莉酸启动的转录因子MYC2与EIN3相互作用，减弱EIN3的转录活性，从而抑制乙烯增强的顶端钩曲率[32～33]。在矮牵牛中也发现，R3-MYB蛋白PhMYBx属于花青素合成的负调控因子[34]。

在本实验中我们发现只有突变体ein3-1eil1-3的种子和叶片呈紫色，且花青素积累量明显高于突变体ein3-1和野生型。通过GUS组织化学染色表明EIN3启动子主要在花、柱头、成熟花粉、种子胚和果荚等生殖器官组织中有较强的表达。EIN3和EIL1基因共同缺失的突变体中花青素含量的增高表明拟南芥转录因子EIN3可能与EIL1共同参与抑制花青素的合成。是花青素合成的负调控因子的新成员。为完善花青素生物合成的分子调控机制提供了新的思路，但是EIN3转录因子抑制花青素合成的具体的调控机制尚不明确，还需进一步研究。MBW(MYB/bHLH/TTG1)蛋白复合体被认为在是花青素生物合成的调节子[35]。尽管在本研究中我们发现EIN3/EIL1是花青素生物合成的负向调控子。然而，核转录因子EIN3/EIL1的下游靶标基因到底编码MBW蛋白复合体中的哪个或哪些基因尚未知道。另外，EIN3/EIL1与下游基因构成的信号转导通路是由什么信号介导的也未知。我们知道EIN3核转录因子既是糖信号分子也是乙烯信号分子[36]。因此，核转录因子EIN3/EIL1与下游靶标基因构成的信号转导通路或许由糖信号分子或乙烯信号分子介导。当然这些只是初步推测，具体通过RT-PCR,ChIP,EMSA，分子遗传等技术从不同角度验证下游靶标基因及信号分子是什么。这也是我们将来工作的重点。

完善花青素生物合成的分子调控机制不仅可以丰富植物次级代谢的理论基础，也可以通过基因工程、代谢工程等生物技术手段提高果实和蔬菜的食用价值和品质。同时也为实现人工调控工业化生产花青素提供科学依据和理论基础。

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Agricultural Science and Technology(Agricultural High-tech Project)(KC16NG063)

introduction：XU Meng-Ke(1993—),female,postgraduate student,whose main research is molecular biology.

date:2017-05-11

ArabidopsisthalianaTranscriptionFactorEthylene-insensitive3(EIN3)InhibitstheSynthesisofAnthocyanins

XU Meng-Ke1,2LI Dan1,2MENG Lai-Sheng1,2*JIANG Ji-Hong1,2

(1.The Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province,Xuzhou 221116；2.College of Life Science,Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116)

Ethylene-insensitive3(EIN3) and EIN3-like1(EIL1) proteins are important nuclear transcription factors in ethylene signal transduction pathways in higher plants. In plants, anthocyanins are one of the water-soluble natural pigments, and they play an important role in the growth and development of plants. We used theArabidopsisthalianadouble mutantein3-1eil1-3 as the research material. Firstly, we identified the mutants ofein3-1eil1-3 andein3-1 by RT-PCR. The direct observation indicated that the seeds and leaves of theein3-1eil1-3 were purple. By ultraviolet spectrophotometer analysis, the anthocyanin accumulation inein3-1eil1-3 mutant was significantly higher than that in theein3-1 mutant and wild-type.GUSstaining showed thatEIN3 was mainly expressed in flowers, stigma, mature pollen, seed embryo and siliques, which was consistent with that anthocyanin accumulation of seeds and leaves was high in mutantein3-1eil1-3. Thus,A.thalianatranscription factor EIN3 as well as EIL1 is involved in the suppression of the anthocyanin synthesis.

ethylene-insensitive3(EIN3)；ethylene-insensitive3-like 1(EIL1)；anthocyanins;Arabidopsisthaliana

农业科技(农业高技术攻关项目)(KC16NG063)

徐梦珂(1993—)，女，硕士研究生，主要从事分子生物学方面的研究。

* 通信作者：E-mail:menglsh@jsnu.edu.cn

2017-05-11

* Corresponding author：E-mail:menglsh@jsnu.edu.cn

Q786

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.018