屏边三七总皂苷的含量测定研究

*

1. 云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500；2.云南省药物研究所，云南 昆明 650111

屏边三七总皂苷的含量测定研究

李莉1刘勇2张美1*

1. 云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500；2.云南省药物研究所，云南 昆明 650111

目的测定屏边三七中总皂苷的含量。方法通过实验研究确定了屏边三七总皂苷检测时的显色条件及检测波长。采用紫外-可见分光光度法测定屏边三七中总皂苷的含量。结果屏边三七中总皂苷在5 %香草醛-冰醋酸和73%的高氯酸溶液中，于65 ℃下加热25 min显色最优，最佳检测波长为543 nm；精密度、稳定性、重复性和加样回收试验等RSD均小于2.5 %。结论屏边三七中总皂苷平均含量为3.60 %。所建立的检测方法可靠、结果稳定、重现性好，其可用于屏边三七中总皂苷的含量测定。

屏边三七；齐墩果酸；总皂苷；紫外-可见分光光度法；含量测定

三七作为名贵药材，其茎有止血疗伤、散瘀镇痛和滋补之效[1]，在民间还有“生打熟补”的功效，即直接使用生药能治疗跌打损伤，而其煮熟后的肉质具有滋补之用。屏边三七(PanaxstipuleanatusTsai et Feng)又称土三七、香刺、白三七、竹节七等，产于云南东南部海拨约为1100 ～ 1700 m的热带雨林如屏边、马关、麻栗坡和河口一带[2]。如图1所示。鉴于目前对屏边三七的整体研究较少，也尚未见到国内(外)关于屏边三七根茎中总皂苷含量测定的文献报道，笔者研究测定屏边三七药材中齐墩果酸型总皂苷类成分的含量，为进一步研究屏边三七根茎中皂苷类成分提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津)；十万分之一电子天平(SHIMADZU)；SK3300LH超声波清洗器；HB10旋转蒸发仪(德国IKA)；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；DHG智能恒温干燥箱(上海景迈仪器设备有限公司)；DFY-C万能高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

1.2 试剂 齐墩果酸对照品(批号：110709-201607，中国食品药品检定研究院)；屏边三七根茎采自云南省河口县莲花滩，经云南中医学院李娅琼教授鉴定为五加科人参属植物屏边三七PanaxstipuleanatusTsai et Feng，其根茎经自然干燥后粉碎，样品过四号筛。实验中甲醇、无水乙醇、香草醛、冰醋酸和高氯酸均为国产分析纯试剂；水为去离子重蒸水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取10.00 mg已干燥至恒重的齐墩果酸对照品，用甲醇溶剂配制成100mL 0.1 mg/mL齐墩果酸对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取药材粗粉0.5 g并将其置于具塞锥形瓶中，加入甲醇溶剂20 mL，随后超声提取30 min，过滤；该滤渣再用甲醇重复提取1次，合并两次滤液，将其用甲醇定容至50 mL，摇匀后即得样品总皂苷提取液。

2.3 总皂苷显色方法和检测波长的确定 鉴于总皂苷和齐墩果酸皂苷元与香草醛-高氯酸/硫酸体系反应后产物在可见光区可获得稳定的特征吸收峰，参照文献[3-7]，研究分别尝试了香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸、香草醛(5%)-乙醇-硫酸和香草醛(5%)-冰醋酸-硫酸三种体系对屏边三七中总皂苷显色的影响研究试验。

2.3.1 香草醛-冰醋酸-高氯酸法 取2.1项下所得对照品溶液0.5 mL，将其置于具塞试管中挥干，随后加入香草醛(5%)- 冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，将其摇匀备用。此混合液在60 ℃水浴中加热20 min，随后加入冷水终止反应，再加入5 mL冰醋酸，混匀。实验中再以不加对照品的溶液作空白对照，在400～800 nm波长范围内进行紫外全波长扫描。所得光谱图如图2所示。

2.3.2 香草醛(5%)-乙醇-硫酸法 取对照品溶液0.5 mL，置于具塞试管中，挥干，加入0.2 mL香草醛(5%)-乙醇溶液以及60 % 的硫酸3 mL，随后在60 ℃水浴中反应20 min，立即用冷水终止反应。实验中再以不加对照品的溶液作空白对照品，在400～800 nm波长范围内进行紫外全波长扫描。实验所得光谱图见下图3所示。

2.3.3 香草醛(5%)-冰醋酸-硫酸法 取对照品溶液0.5 mL，置于具塞试管中，挥干，随后加入香草醛(5 %)-冰醋酸溶液0.2 mL和60 %硫酸3 mL。将此溶液在60 ℃水浴中加热反应20 min后取出，随即用冷水终止反应。实验中以不加对照品的溶液作空白对照品，在400 ～ 800 nm波长范围内进行紫外全波长扫描。所得紫外吸收光谱图见图4。

从图2、图3和图4可看出，香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸法的灵敏度高、稳定性好，故选此体系为屏边三七中总皂苷显色的试剂。从图2可以看出，该显色方法下的最大紫外吸收波长为543 nm，故选择543 nm作为检测波长。

2.4 香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸显色法中显色剂用量的选择 在显色实验中，香草醛(5%)-冰醋酸溶液的用量和高氯酸的用量将直接影响生成有色物质的多少，从而影响紫外吸收。

2.4.1 香草醛(5%)-冰醋酸溶液用量的选择 取0.5 mL齐墩果酸对照品溶液共5份，分别置于具塞试管中挥干，各加入香草醛(5%)-冰醋酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，随后再各加入0.8 mL高氯酸。将此6份混合液置于60℃水浴中反应20 min，随即加入少量冷水终止反应，10 min后再加5 mL冰醋酸，摇匀备用。将以上制备的溶液在543 nm波长处测定吸收值，结果见表1。实验结果显示，香草醛(5%)-冰醋酸溶液用量为0.3 mL时溶液吸收值最强，故为增强屏边三七中总皂苷显色的灵敏度，试验中选择加入0.3 mL香草醛(5%)-冰醋酸溶液。

表1 5%香草醛-冰醋酸溶液用量结果

2.4.2 高氯酸用量的选择 分别取齐墩果酸对照品溶液0.5 mL各6份，将其置于具塞试管中挥干，分别加入香草醛(5%)-冰醋酸溶液0.3 mL，再各加入高氯酸0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，摇匀溶液，将其置于60 ℃水浴中反应 20 min，随后用冷水终止反应，10 min后再各加 5 mL冰醋酸，摇匀备用。将所制备的溶液分别在543 nm波长处测定吸收值，结果见表2。实验结果显示，高氯酸用量为0.8 mL时，其紫外吸收值最大，故测定时以0.8 mL高氯酸用量为最佳。

表2 高氯酸用量结果

2.4.3 加热温度的选择 在以上确定的最佳条件的基础上，考察显色时加热温度的影响，具体操作如下：分别取0.5 mL齐墩果酸对照品溶液5份，置于具塞试管中，挥干，分别加入香草醛(5 %)-冰醋酸溶液0.3 mL和高氯酸0.8 mL，随即分别置于50、55、60、65、70℃水浴中加热20 min后取出，再分别加入少量冷水终止反应，10 min后依次加入冰醋酸5 mL，摇匀备用。将所得溶液在543 nm波长处测定吸收值，结果见表3。实验结果显示，总皂苷与显色试剂在65 ℃反应时，溶液的紫外吸收强度最大，故该加热温度最佳。

表3 加热温度的选择

2.4.4 加热时间的选择 分别取0.5 mL齐墩果酸对照品溶液5份，置于具塞试管中，挥干，分别加入香草醛(5%)-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀。随后在65 ℃水浴中分别加热10、15、20、25、30 min后取出，再加入少量冷水终止反应，最后加入冰醋酸5 mL，摇匀备用。将所制备的溶液分别在543 nm波长处测定吸收值，实验结果显示，反应加热时间为25 min时最佳。

2.5 含量的测定

2.5.1 标准曲线的制备 精密吸取齐墩果酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于具塞试管中挥干，随后加入香草醛(5 %)-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸0.8 mL，并在65 ℃水浴中分别加热25 min后取出，用冷水终止反应，随后加入5 mL冰醋酸，摇匀备用。将显色后的溶液在543 nm波长处分别测定吸收值，随后以浓度C(μg/mL)为横坐标、吸光度A为纵坐标来绘制标准曲线。该标准曲线的回归方程为：Y=0.031X+0.0032，其相关系数r=0.9998，且齐墩果酸在3.278～19.672 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验 精密量取同一对照品，按2.5.1项下显色方法操作制备显色溶液，重复测定6次，其相对标准偏差RSD为0.33%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密称取药材粗粉0.5 g，按“2.2”项下操作方法制备供试品溶液，再按2.5.1项下的显色方法显色，随后分别于0、10、20、30、40、50和60 min测定其吸光度，实验所得RSD为 0.16 %，表明方法显色后的样品溶液在60 min内稳定。

2.5.4 重复性试验 精密称取0.5 g药材粗粉6份，按“2.2”项下操作方法制备供试品溶液，再按2.5.1项下显色方法显色，并分别在543 nm下测定显色后溶液的吸光度，最后根据标准曲线计算其总皂苷含量平均值为：3.67%，且RSD为0.88%。结果表明，该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液0.4 mL，随后加入齐墩果酸对照品溶液1.0 mL，按2.5.1项下方法显色操作并测定吸收度，再按公式1计算加样回收率，所测定结果见表4。

表4 加样回收率试验结果

2.5.6 样品的含量测定 精密称取药材粗粉6批，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按2.5.1项下所示显色方法显色，并在543 nm下测定显色后溶液的吸光度，从而测定样品含量。实验结果表明，样品中总皂苷的含量分别为：3.60%、3.67%、3.55%、3.54%、3.71%和3.60%，平均含量为3.60%，其RSD为1.85%。

3 结果与讨论

3.1 总皂苷显色方法 实验中分别采用香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸、香草醛(5%)-乙醇-硫酸和香草醛(5%)-冰醋酸-硫酸三种体系对药材提取物进行显色，显色后溶液的紫外分光光谱图显示同等条件下香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸体系的灵敏度高、稳定性好，故选此体系为屏边三七中总皂苷显色的试剂。

3.2 显色条件 在显色实验中，显色剂加入的量以及反应的温度和时间会直接影响显色的效果，因此，实验中还分别探讨了香草醛(5%)-冰醋酸溶液用量由0.1～0.5 mL，高氯酸用量由0.6～1.6 mL，加热温度由50～70 °C，加热时间由10～30 min等单因素变化过程中吸光度的变化值。由实验结果可知，各单因素下溶液的最大紫外吸收值对应的条件分别为：0.3 mL香草醛(5 %)-冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸、反应温度65 ℃以及反应时间为25 min。故最佳显色条件为香草醛(5 %)-冰醋酸和73%高氯酸溶液，在65 ℃下反应25 min，检测波长为543 nm。

3.3 含量测定以及所建立方法的系统适用性实验 为测定屏边三七样品中齐墩果烷型的总皂苷含量，实验中采用了标准工作曲线法。实验结果表明，所绘制标准曲线的回归方程为：Y=0.031X+0.0032，其相关系数r=0.9998。同时，根据精密度(RSD为0.33%)、稳定性(RSD为0.16%)、重复性(RSD为0.88%)和加样回收率(平均加样回收率为99.08%，RSD为2.11%)等数据，说明实验结果可靠、稳定，且重现性好。在此条件下，6批样品中总皂苷含量的平均含量为3.60%，其RSD为1.85%。

屏边三七中主要药理活性成分是齐墩果烷型五环三萜皂苷，本研究创新性地采用紫外分光光度法测定屏边三七总皂苷的含量。实验探讨了目标三萜皂苷所用的显色剂种类、显色条件以及最终检测波长等条件。同时，经精密度、稳定性、重复性和加样回收率等系统适用性实验的验证，证明该测定结果稳定、可靠且重现性好。最后，采用标准曲线法，测定了屏边三七总皂苷的平均含量为3.60 %，其RSD为1.85 %。研究结果表明紫外分光光度法测定屏边三七总皂苷含量的方法操作简便，其结果可靠、稳定，且重现性好。该研究为屏边三七的质量控制和进一步开发利用提供科学依据。

[1] 中国科学院昆明植物研究所. 云南植物志(2卷)[M]. 北京: 科学出版社, 1979: 513.

[2] 杨崇仁, 姜志东, 周俊, 等. 屏边三七根茎中的两个新的齐墩果酸皂甙[J]. 云南植物研究, 1985, 7(1): 103-108.

[3] 王立业, 贾强, 阎玺庆, 等. 紫外分光光度法测定七叶莲中总皂苷的含量[J].中国药房, 2008, 19(15): 1157-1176.

[4] 冯磊, 陈爽, 邱丽颖, 等. 紫外分光光度法测定合欢皮总皂苷的含量[J]. 华西医学杂志, 2009, 24(6): 642-644.

[5] 张世梅, 杨艳, 陈萍,等. 鸡肉参中总三萜含量的测定[J]. 大理学院学报, 2011, 10(12): 21-23.

[6] 任亚硕, 吴德玲, 张伟, 等. 紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总三萜含量 [J]. 安徽中医学院学报, 2012, 31(5): 78-80.

[7] 张小鸿, 吴杨峥, 徐先祥. 不同显色剂对牛膝总皂苷含量测定的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(21): 113-116.

DeterminationofTotalSaponinsinPanaxstipuleanatusTsai

LI Li1LIU Yong2ZHANG Mei1*

1. College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500，China；2. Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111，China

ObjectiveTo study the content of total saponins forPanaxstipuleanatusTsai.MethodsThe chromogenic conditions and detection wavelength of the total saponins for Panax stipuleanatus were determined by the experimental study and the determination of it by UV Spectrophotometry.ResultsWhen thePanaxstipuleanatusTsai was reaction at 65 ℃ for 25 min in solution of 5% vanillinacetic acid and 73% perchloric acid, and detected at 543 nm was optimum. The method of determination was proved to be simple，precise and reproducible since theRSDfor precision, repeatability, stability and sample recovery rate was lower than 2.5%, respectively.ConclusionThe average detection content was 3.60% according to the method. The study showed that this method can be used for the quantitative determination of the total saponins inPanaxstipuleanatusTsai.

PanaxstipuleanatusTsai; Oleanolic Acid; Total Saponins; UV-Visible Spectrophotometry; Content Determination

云南卫生厅科研项目(KY14)，国家自然科学基金项目(21665030)，云南省教育厅科研项目(2015Z122)。

李莉(1968-)，女，汉族，本科，实验师，研究方向为中药化学及中药质量控制研究。E-mail: LiLi_0429@163.com

张美(1984-)，女，汉族，博士研究生，讲师，研究方向为药物分析。E-mail：meizhang213@163.com

R284.1

A

1007-8517(2017)24-0018-05

2017-11-17 编辑：邓佳丽)