眼皮肤白化病一家系基因突变分析

胡苏玮 何晓燕 李洁 朱湘玉 徐贵江 张坡

225002江苏，扬州大学医学院附属医院 扬州市妇幼保健院医学遗传中心（胡苏玮、何晓燕、徐贵江、张坡）；南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科（李洁、朱湘玉）

·研究报道·

眼皮肤白化病一家系基因突变分析

胡苏玮 何晓燕 李洁 朱湘玉 徐贵江 张坡

225002江苏，扬州大学医学院附属医院 扬州市妇幼保健院医学遗传中心（胡苏玮、何晓燕、徐贵江、张坡）；南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科（李洁、朱湘玉）

目的利用靶向二代测序技术对1个眼皮肤白化病家系进行基因突变分析。方法收集1个眼皮肤白化病家系的临床资料，提取先证者及其父母外周血DNA。通过高通量测序技术，对先证者TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2等29个基因的外显子编码区进行直接测序，寻找可能存在的基因突变。以Sanger测序技术检测先证者父母的相应基因位点。结果先证者TYR基因检测到2个杂合突变，分别是c.534G ＞C（p.Trp178Cys）和c.1147G ＞A（p.Asp383Asn）。其中c.534G ＞C突变为新发突变，c.1147G＞A突变为已知致病突变。先证者父母TYR基因突变检测结果证实，先证者的c.534G＞C突变来自父亲，c.1147G＞A突变来自母亲。结论应用靶向二代测序技术为一个眼皮肤白化病家系确定了TYR基因致病性新突变c.534G＞C。

白化病，眼皮肤；基因分型技术；突变；产前诊断

白化病（albinism）是一组由黑素生物合成缺陷引起的常染色体隐性遗传病。临床上白化病分为非综合征型和综合征型。非综合征型白化病又分为眼白化病（ocular albinism，OA）和眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism，OCA）。眼皮肤白化病以皮肤、毛发和眼睛的部分或完全性黑素缺乏和视力低下、畏光等为主要表现。OCA具有高度遗传异质性，根据致病基因不同，目前共分为7种亚型［1］，常见的OCA1～4型分别由酪氨酸酶基因（tyrosinase，TYR）、P蛋白基因、酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase⁃related protein 1，TYRP1）以及膜相关转运蛋白（membrane⁃associated transport protein，MRTP）基因突变导致。OCA5～7型临床上较为罕见。眼皮肤白化病各型在临床表型方面具有一定的重叠和交叉，仅依据临床表现难以准确分型，分子诊断是分型的唯一依据。我们利用靶向二代测序（targeted next⁃generation sequencing，TGS）方法对一个OCA家系进行基因突变分析。

一、临床资料

先证者男，18个月龄，头发、皮肤黑素完全缺失，眉毛黑素部分缺失；虹膜色淡，畏光，眼球水平震颤，临床表现符合白化病的表型特征。先证者父母表型均正常，非近亲结婚，孕期无用药史和不良环境接触史。先证者母亲家族中曾有1例白化病患者，已病故，死因不详。先证者母亲现再次妊娠，孕16周时至我院遗传中心咨询，要求进行白化病基因检测及产前诊断。患者家系图见图1。本研究通过扬州市妇幼保健院医学伦理委员会批准，患者亲属签署知情同意书。

二、方法

1.高通量基因测序：采集先证者及其父母外周静脉血2 ml，采用QIAamp DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取基因组DNA，并测量其吸光度值。提取的DNA用DNA酶片段化后进行纯化，随后PCR扩增并连接上接头序列，使用TruSight One Sequencing Panel（美国Illumina Inc公司）试剂盒经2次捕获及纯化，PCR扩增和纯化，获得最终文库，在MiSeq测序仪（美国Illumina Inc公司）上对TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2等29个基因外显子区进行高通量测序，该测序由广州金域医学检验中心提供技术支持。

2.数据分析：所有数据用BWA算法比对到参考序列（UCSC hg19），ANNOVAR工具对数据进行注释。使用千人基因组计划数据库（http：//www.internationalgenome.org/）、ESP6500数据库（http：//evs.gs.washington.edu/EVS/）、HGMD（Human Gene Mutation Database）数据库（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）筛选、注释；SIFT（Soring intolerant from tolerant）、Polyphen⁃2（Polymorphism phenotype）软件进行错义变异的生物信息学分析。综合各个基因变异的频率、基因功能、遗传方式、文献报道等信息，结合患者的临床表型信息，筛选候选突变。

3.Sanger测序验证：从UCSC Genome Bioinformatics数据库（http：//genome.ucsc.edu）中提取TYR基因相关序列作为参考序列，针对候选突变的位点，用Primer Premier 5.0软件设计引物，用于扩增TYR基因c.534G＞C突变的引物序列为TYR⁃E1⁃4F：5′⁃CATCTTCGATTTGAGTG CCC⁃3′，TYR⁃E1⁃4R：5′⁃CCCTGCCT GAAGAAGTGATT⁃3′；用于扩增c.1147G＞A突变的引物序列为TYR⁃E3⁃F：5′⁃AGTTATAAATCAAA TGGGATAATCA⁃3′，TYR⁃E3⁃R：5′⁃ACATTTGATAGGCACCCTCT ⁃3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，Sanger测序验证。

图1 眼皮肤白化病家系图 a：16周未出生胎儿

4.氨基酸进化保守性分析：从UCSC Genome Bioinformatics数据库（http：//genome.ucsc.edu）中提取人、小鼠、大鼠、斑马鱼和兔的TYR基因对应的氨基酸序列，使用ClustalX2.1软件（http：//www.clustal.org）进行多序列比对，观察错义突变位点编码的氨基酸在5个不同物种间的进化保守性。

5.羊水TYR基因产前检测：孕20周时，对先证者母亲进行羊膜腔穿刺术，并抽取25 ml羊水进行染色体核型分析和TYR基因突变位点检测。

三、结果

靶向二代测序结果显示，先证者TYR基因存在2个杂合变异，分别是 Exon1：c.534G ＞ C（p.Trp178Cys）和 Exon3：c.1147G＞A（p.Asp383Asn）。其中c.534G＞C突变引起所编码蛋白质的第178位氨基酸由Trp突变为Cys；HGMD、ESP6500、dbSNP和千人基因组数据库均未收录该变异。c.1147G＞A突变引起所编码蛋白质的第383位氨基酸由Asp突变为Asn；ESP6500和千人基因组数据库均未收录该变异，dbSNP数据库有收录（rs121908011），A等位基因频率为0.000 164 73。

图2 TYR基因突变位点测序结果 先证者第1外显子发生突变c.534G＞C（2A），第3外显子发生突变c.1147G＞A（2B）；先证者父亲携带突变c.534G＞C（2C），先证者母亲携带突变c.1147G＞A（2D）。箭头所指为发生突变碱基

根据常染色体隐性遗传病的遗传规律，对先证者父母进行TYR基因突变位点检测（图2），证实先证者c.534G＞C变异来自父亲，c.1147G＞A变异来自母亲。利用Polyphen⁃2软件对c.534G＞C（p.Trp178Cys）进行错义变异的生物信息学分析，结果显示，该突变为“probably damaging”，分数为1.0。多物种氨基酸序列分析显示，c.534G＞C位点所编码的氨基酸在所分析的5种生物中具有高度进化保守性（图3）。

图3 TYR基因突变位点在5个不同物种间的氨基酸进化保守性分析 黑色方框所在位置为突变c.534G＞C（p.Trp178Cys）对应的密码子，*表示该位点在物种间高度保守

对先证者母亲本次妊娠的胎儿进行羊水穿刺、染色体核型分析显示，胎儿染色体正常，为TYR基因c.1147G＞A突变杂合子，未遗传父亲的突变位点。

四、讨论

白化病具有高度遗传异质性。采用传统的Sanger测序技术对遗传异质性高的疾病基因诊断，存在测序效率低、成本高、测序通量低、难以满足多个基因测序需求的缺点。二代测序技术，也称为大规模平行测序（massively parallel DNA sequencing），其基本原理是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列，构建测序文库、锚定桥接、预扩增、单碱基延伸测序和数据分析等步骤，更全面、深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用等各项数据［2］。二代测序包括全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、全外显子测序（whole exome sequencing，WES）、靶向基因测序（targeted gene sequening，TGS）［2］。本研究采用靶向二代测序的方法，对该家系的先证者进行29个白化病相关基因检测，在TYR基因检测到先证者2个杂合变异，经Sanger测序验证结果准确无误。

TYR基因位于11q14.3，由5个外显子和4个内含子组成，其编码的酪氨酸酶具有酪氨酸羟化酶活性，是黑素合成过程的关键酶［3］。TYR基因突变引起的眼皮肤白化病属于OCA1型，以常染色体隐性遗传方式遗传，患者的父母往往均携带致病突变。OCA1型又分为OCA1A和OCA1B，后者随年龄增长，色素可能会有所增加［4］。本文先证者眉毛和虹膜色素较出生时稍有增加，应属于OCA1B型白化病。

错义突变是OCA1型患者最常见的突变类型，大部分突变都位于该基因的4个区域［5⁃6］。本研究中先证者的2个杂合突变，分别是Exon1：c.534G＞C和Exon3：c.1147G＞A，均为错义突变，其中c.534G＞C突变未见文献报道，c.1147G＞A为已报道突变。c.534G＞C突变所在的区域为突变热点区域，该区域已报道的突变包括 c.533G ＞ A［7］、c.535A ＞ T［8］、c.538C ＞ A［8］、c.539A ＞ G［9］。同源序列比对分析显示，c.534G＞C突变引起的氨基酸改变发生于1个高度保守的氨基酸残基上。先证者的2个TYR基因突变均处于酪氨酸酶的Cu2+结合区，分别位于CuA和CuB结构域，很可能影响了酪氨酸酶的Cu2+结合活性，从而降低该酶的活性，影响黑素的形成，导致OCA1发生［9］。先证者父母分别是上述两种致病突变的杂合携带者。c.534G＞C突变在HGMD、ESP6500、dbSNP和千人基因组数据库中均未被收录，其位于突变热点区域，为新发变异，并在父亲中得到验证，生物信息学分析显示该突变为“probably damaging”，根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）对基因突变的解读标准及指导原则，综合考虑该突变为致病性突变。携带致病突变的父母每次生育子女均有25%的可能为白化病患者。夫妇双方均为携带者的家庭再次妊娠时需做白化病产前基因诊断，以避免再次生育类似病情的患儿。

［1］Liu J,Choy KW,Chan LW,et al.Tyrosinase gene（TYR）muta⁃tions in Chinese patients with oculocu⁃taneous albinism type 1［J］.Clin Exp Ophthalmol,2010,38（1）:37⁃42.DOI:10.1111/j.1442⁃9071.2009.02220.x.

［2］Lohmann K,Klein C.Next generation sequencing and the future of genetic diagnosis［J］.Neurotherapeutics,2014,11（4）:699 ⁃707.DOI:10.1007/s13311⁃014⁃0288⁃8.

［3］SimeonovDR,WangX,WangC,etal.DNAvariationsinoculocuta⁃neous albinism:an updated muta⁃tion list and current outstanding issues in molecular diagnostics［J］.Hum Mutat,2013,34（6）:827⁃835.DOI:10.1002/humu.22315.

［4］Karaman A.Oculocutaneous albinism type 1A:a case report［J/OL］.Dermatol Online J,2008,14（11）:13［2016⁃09⁃01］.http://escholarship.org/uc/item/1w92n37.

［5］Lin YY,Wei AH,Zhou ZY,et al.A novel missense mutation of the TYR gene in a pedigree with oculocutaneous albinism type 1 from China［J］.Chin Med J（Engl）,2011,124（20）:3358⁃3361.DOI:10.3760/cma.j.issn.0366⁃6999.2011.20.027.

［6］King RA,Mentink MM,Oetting WS.Non⁃random distribution of missense mutations within the human tyrosinase gene in type I（tyrosinase⁃related）oculocutaneous albinism［J］.Mol Biol Med,1991,8（1）:19⁃29.

［7］Giebel LB,Musarella MA,Spritz RA.A nonsense mutation in the tyrosinase gene of Afghan patients with tyrosinase negative（type IA）oculocutaneous albinism［J］.J Med Genet,1991,28（7）:464⁃467.DOI:10.1136/jmg.28.7.464

［8］Opitz S,Käsmann⁃Kellner B,Kaufmann M,et al.Detection of 53 novel DNA variations within the tyrosinase gene and accumulation of mutations in 17 patients with albinism［J］.Hum Mutat,2004,23（6）:630⁃631.DOI:10.1002/humu.9248.

［9］Ghodsinejad KV,Kamalidehghan B,Arasteh KA,et al.Two novel tyrosinase（TYR）gene mutations with pathogenic impact on oculocutaneous albinism type 1 （OCA1）［J/OL］.PLoS One,2014,9（9）:e106656［2016 ⁃09 ⁃01］.http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0106656.DOI:10.1371/journal.pone.0106656.

Mutation analysis in a pedigree with oculocutaneous albinism

Hu Suwei,He Xiaoyan,Li Jie,Zhu Xiangyu,Xu Guijiang,Zhang Po
Medical Genetic Center,Yangzhou Maternal and Child Care Service Centre,The Affiliated Hospital of Yangzhou University Medical College,Yangzhou 225002,Jiangsu,China（Hu SW,He XY,Xu GJ,Zhang P）;Department of Obstetrics and Gynecology,Nanjing Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China（Li J,Zhu XY）

Hu Suwei,Email:husuwei2004@126.com

ObjectiveTo investigate gene mutations in a pedigree with oculocutaneous albinism by using targeted next⁃generation sequencing technology.MethodsClinical data were collected from a pedigree with oculocutaneous albinism.Genomic DNA was extracted from peripheral blood cells of the proband and his parents.High⁃throughput sequencing technology was used for sequence analysis of coding regions in exons of 29 genes including TYR,OCA2,TYRP1 and SLC45A2 in the proband to find potential pathogenic gene mutations.Sanger sequencing was conducted to detect the corresponding genetic loci in the parents.ResultsTwo heterozygous mutations were identified in the TYR gene of the proband,including a novel mutation c.534G ＞ C（p.Trp178Cys）and a known mutation c.1147G ＞ A（p.Asp383Asn）.The detection of the TYR gene mutations in the parents of the proband showed that the c.534G＞C and c.1147G＞A mutations in the proband were inherited from his father and mother respectively.ConclusionA novel pathogenic mutation c.534G＞C in the TYR gene is identified in the pedigree with oculocutaneous albinism by using targeted next⁃generation sequencing technology.

Albinism,oculocutaneous;Genotyping techniques;Mutation;Prenatal diagnosis

Fund programs:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140101）;Maternal and Child Health Research Project of Jiangsu Province（F201672）;Yangzhou Science and Technology Planning Project（YZ2016064）

胡苏玮，Email：husuwei2004@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.011

江苏省自然科学基金（BK20140101）；江苏省妇幼健康科研项目（F201672）；扬州市科技计划项目（YZ2016064）

2016⁃12⁃08）

朱思维 颜艳）