肿瘤坏死因子α基因启动子多态性与泛发性脓疱性银屑病相关性研究

龙福泉 刘业强 钱伊弘 蒙秉新 赵丽诗 王千秋

200043上海市皮肤病医院性病科（龙福泉、钱伊弘、赵丽诗），病理科（刘业强）；海南省人民医院皮肤科（蒙秉新）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所性病临床防治室（王千秋）

·论著·

肿瘤坏死因子α基因启动子多态性与泛发性脓疱性银屑病相关性研究

龙福泉 刘业强 钱伊弘 蒙秉新 赵丽诗 王千秋

200043上海市皮肤病医院性病科（龙福泉、钱伊弘、赵丽诗），病理科（刘业强）；海南省人民医院皮肤科（蒙秉新）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所性病临床防治室（王千秋）

目的探讨肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）基因启动子区域多态性与泛发性脓疱性银屑病的相关性。方法检测对象为91例汉族泛发性脓疱性银屑病患者及102例汉族健康体检者，应用PCR及直接测序法分析TNF⁃α基因启动子区域⁃238、⁃308、⁃857位点多态性。结果泛发性脓疱性银屑病患者与健康对照组TNF⁃α⁃238位点G/A等位基因频率差异有统计学意义（P=0.003；OR=4.819，95%CI：1.581～14.694），基因型GG与GA/AA在两组间的分布差异也有统计学意义（P=0.006；OR=4.455，95%CI：1.410～ 14.077）；TNF⁃α⁃308位点G/A等位基因频率以及基因型GG与GA/AA的分布在两组间差异无统计学意义（P值分别为0.794、0.786）；TNF⁃α⁃857位点C/T等位基因频率以及基因型CC与CT/TT的分布在两组间差异无统计学意义（P值分别为0.474、0.453）。结论TNF⁃α⁃238G＞A多态性可能与泛发性脓疱性银屑病发病相关。

银屑病；肿瘤坏死因子α；多态性；单核苷酸；转录启动子；泛发性脓疱性银屑病

泛发性脓疱性银屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）是银屑病的一种严重类型，发病机制尚不明确。研究发现，遗传易感因素在GPP发病机制中起到一定作用［1⁃2］。既往研究表明，肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）基因启动子区域存在多态性位点，TNF⁃α⁃238G ＞ A（rs361525）、⁃308G ＞ A（rs1800629）及⁃857C＞T（rs1799724）多态性与寻常性银屑病及银屑病性关节炎相关［3⁃4］。我们采用PCR及DNA直接测序检测GPP与TNF⁃α基因启动子区域多态性位点的相关性，探讨GPP的遗传发病机制。

对象与方法

一、对象

2010年9月至2012年6月分别在中国医学科学院皮肤病医院、海南省人民医院收集汉族GPP患者91例，其中男61例，女30例，年龄5～62（24.0±10.6）岁。诊断标准参照文献［5］，患者之间无血缘关系。对照组为102例汉族健康体检者，无遗传性、家族性疾病或严重系统性疾病，其中男67例，女35例，年龄11～58（26.7±9.0）岁。两组之间性别（χ2=0.224，P＞ 0.05）及年龄（t=1.886，P＞ 0.05）差异均无统计学意义。样本采集前均签署知情同意书。

二、方法

采集受试者外周血2 ml，置于乙二胺四乙酸二钠抗凝管中，-20℃冻存。使用血液基因组DNA快速抽提试剂盒［生工生物工程（上海）有限公司］提取并纯化DNA，按照试剂盒说明操作。检测质量和浓度后，将提取DNA稀释为10 mg/L，-20℃保存。PCR引物设计参照文献［6⁃7］，引物序列见表1。PCR反应体系（50 μl）含10 × 缓冲液5 μl，200 μmol/L dNTP 2 μl，P1、P2 引物（10 pmol/L）各 2 μl，小牛血清蛋白 2 μl，5 U/μl TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，超纯水36 μl，5 × DNA模板2 μl。短暂混匀后，置 PCR仪上，95℃预变性4 min，94℃变性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40个循环，最后72℃再延伸10 min，4℃保温。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测，使用小量胶回收试剂盒回收，最后将回收产物-20℃冻存备用。

表1 引物序列及产物长度

测序反应体系：回收PCR产物2 μl，Big DyeTM2 μl，1 pmol/L 引物 1 μl（采用 P1 作为测序反应引物）。混匀后，96℃10 s，50℃5 s，60℃ 4 min，共25个循环，4℃保温。反应结束后，采用异丙醇法对产物进行纯化，最后使用ABI Prism3700测序仪（美国Applied Biosystems公司）电泳、测序。对测序结果用DNA Star软件包分析。

三、统计学方法

采用SPSS18.0软件分析，计数资料采用χ2检验分析，计算比值比（OR）和95%可信区间（CI），以OR＞1为有病因学联系。计量资料采用t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。所有统计学检验均为双侧检验。

结 果

测序结果表明，GPP患者与健康对照组TNF⁃α启动子区域存在⁃238G＞A、⁃308 G＞A及⁃857C＞T碱基突变，3个SNP位点的等位基因频率以及基因型分布见表2。χ2检验显示，GPP患者与健康对照TNF⁃α⁃238位点（rs361525）G/A等位基因频率差异有统计学意义（P=0.003；OR=4.819，95%CI：1.581～14.694）；基因型GG与GA/AA在两组间的分布差异亦有统计学意义（P=0.006；OR=4.455，95%CI：1.410 ～ 14.077）；TNF⁃α⁃308位 点（rs1800629）G/A等位基因频率以及基因型GG与GA/AA的分布在两组间差异均无统计学意义（P值分别为0.794、0.786）；TNF⁃α⁃857位点（rs1799724）C/T等位基因频率以及基因型CC与CT/TT的分布在两组间差异亦无统计学意义（P值分别为0.474、0.453）。

讨 论

GPP是银屑病较为严重的少见临床类型，约占银屑病患者的1.3%［8］。GPP病因及发病机制复杂，感染、药物、糖皮质激素突然停药、精神压力、内分泌异常等因素可诱发该病［5］。Marrakchi等［9］对9 个突尼斯GPP家系患者进行纯合子定位和直接测序，首次发现IL36RN可能是GPP的致病基因。Sugiura等［10］和 Berki等［11］发 现 ，CARD14c.526G ＞ C（p.Asp176His）杂合突变是寻常性银屑病患者继发GPP的一个重要易感因素。也有研究发现，TNIP1、CARD14碱基改变与GPP有关［2，12］。作为银屑病的一个亚型，GPP显示出其独特的发病机制，同时也与寻常性银屑病有类似的遗传基础。

表2 肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）启动子区不同位点等位基因及基因型在泛发性脓疱性银屑病（GPP）患者与对照组中的频率

TNF⁃α启动子区域有多个多态性位点，Meta分析表明，TNF⁃α⁃238G＞A和⁃308G＞A多态性是寻常性银屑病风险预测的生物学标记，并可能与疾病严重程度相关［3⁃4，13⁃14］。我们既往研究也表明，TNF⁃α⁃238G＞A与早发型寻常性银屑病有关［15］。Nishibu等［16］研究6例GPP合并关节炎患者，1例发生TNF⁃α⁃308AA纯合子突变，但限于病例较少，无法从统计学角度证明其相关性。

我们对91例GPP患者的研究表明，TNF⁃α⁃238位点多态性与GPP相关，TNF⁃α⁃238G＞A多态性可能是导致GPP的原因之一，但未发现⁃308 G＞A及⁃857C＞T多态性与GPP相关。将来仍需进行大规模、多种族的临床研究，进一步揭示TNF⁃α启动子区域多态性在GPP发生发展中的作用。另外，TNF⁃α基因在MHC中的位置特殊，TNF启动子基因多态性与MHCⅠ类及Ⅱ类基因在GPP发病中是单独起作用还是共同发挥作用，有待于进一步研究。同时，有资料表明，TNF⁃α⁃238G ＞ A、⁃308 G ＞ A及⁃857C＞T多态性改变与寻常性银屑病患者对TNF⁃α阻断剂的敏感性相关［17］。TNF⁃α启动子区域⁃238G ＞ A多态性改变可能会诱导TNF⁃α高表达［7］，而TNF⁃α作为一种前炎症细胞因子，可通过诱导炎症反应参与GPP发病环节［18］。一些生物制剂尤其是TNF⁃α阻断剂治疗儿童顽固性GPP有较好疗效［19⁃20］，进一步说明 TNF⁃α在 GPP致病机制中起到一定作用。因此，有必要进一步扩大样本量，深入研究TNF⁃α启动子基因多态性是否导致GPP患者产生异常活性的前炎症细胞因子TNF⁃α，从而影响GPP进程，并进而评估临床应用TNF⁃α阻断剂治疗对常规药物抵抗的GPP患者的可行性，对GPP治疗提供一个新的思路。

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Association of tumor necrosis factor⁃α gene promoter polymorphisms with generalized pustular psoriasis

Long Fuquan,Liu Yeqiang,Qian Yihong,Meng Bingxin,Zhao Lishi,Wang Qianqiu
Department of Venereology,Shanghai Dermatology Hospital,Shanghai 200043,China（Long FQ,Qian YH,Zhao LS）;Department of Pathology,Shanghai Dermatology Hospital,Shanghai 200043,China（Liu YQ）;Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,China（Meng BX）;Department of Sexually Transmitted Disease Clinical Management,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang QQ）

Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

ObjectiveTo investigate the association of tumor necrosis factor⁃α（TNF⁃α）gene promoter polymorphisms with generalized pustular psoriasis.MethodsTotally,91 patients of Han nationality with generalized pustular psoriasis（generalized pustular psoriasis group）and 102 health checkup examinees（healthy control group）were enrolled into this study.PCR and direct sequencing were performed to analyze the ⁃238,⁃308 and ⁃857 polymorphic sites of the TNF⁃α promoter.ResultsThe frequency of the A allele at TNF⁃α⁃238 site was significantly higher in the generalized pustular psoriasis group than in the healthy control group（P=0.003,OR=4.819,95%CI:1.581-14.694）,so was the frequency of GA/AA genotype（P=0.006,OR=4.455,95%CI:1.410-14.077）.However,no significant differences were observed in the frequencies of G/A alleles（P=0.794）and GG/GA/AA genotypes（P=0.786）at TNF⁃α⁃308 site,or in the frequencies of C/T alleles（P=0.474）and CC/CT/TT genotypes（P=0.453）at TNF⁃α⁃857 site,between the generalized pustular psoriasis group and healthy control group.ConclusionTNF⁃α⁃238G ＞ A polymorphisms may be associated with the occur⁃rence of generalized pustular psoriasis.

Psoriasis;Tumor Necrosis Factor⁃alpha;Polymorphism,single nucleotide;Transcrip⁃tion Initiation Site;Generalized pustular psoriasis

Fund programs:Shanghai Municipal Natural Science Foundation（14ZR143700）；Natural Science Foundation of Hainan Province of China（813219）

王千秋，Email：wangqq@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.005

上海市自然科学基金（14ZR143700）；海南省自然科学基金（813219）

2017⁃03⁃03）

尚淑贤）