原发性肾病综合征患儿肾组织P-gp170蛋白和mRNA表达与临床病理及预后的关系

刘广涛 关凤军 董 晨

摘   要：目的  观察原发性肾病综合征患儿肾组织中P-糖蛋白170的表达，分析肾组织中P-gp170表达与临床和病理的关系，探讨P-gp170表达在PNS 患儿GC耐药中的作用。方法  采用肾活检术取得96例处于不同病程的PNS患儿肾组织标本，进行常规病理学诊断和肾脏病理定量分析;应用免疫组织化学及原位杂交法分别检测PNS患儿肾组织中P-gp170蛋白及mRNA的表達，比较不同肾脏病理类型及病理积分患儿P-gp170的表达;比较未用GC与应用GC后PNS患儿肾组织P-gp170的表达。结果  ①正常肾脏即有一定量的P-gp170表达;未用GC组即高于正常对照，差异有统计学意义（P<0.05）;②病理积分较高者P-gp170表达阳性量高于病理积分低者，差异有统计学意义（P<0.05）;不同病理类型P-gp170的表达有差异，局灶节段硬化（FSGS）、膜性肾病（MN）和硬化性肾病（SGN）表达较高，组间比较差异无统计学意义（P>0.05），微小病变（MCD）和系膜增生型（MsPGN）者表达较低，两者比较差异无统计学意义（P>0.05）;而前三者与后两者差异有统计学意义（P<0.05）;③未用GC者较应用GC后的PNS患儿肾组织P-gp170表达量低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  P-gp170在PNS患儿肾组织的表达可能与肾病病损有关，可结合病理类型和病理损伤程度同时检测肾组织P-gp170预测不同患儿GC反应性; P-gp170的表达增高可能与PNS活动和复发有关，可作为临床预测预后的指标。

关键词：肾病综合征;P-糖蛋白170;糖皮质激素;耐药;儿童

中图分类号：R726.9                                    文献标识码：A                              DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.21.017

文章编号：1006-1959（2018）21-0061-05

Relationship between the Expression of p-gp170 Protein and mRNA in Renal Tissue of Children with Primary Nephrotic Syndrome and Clinical Pathology and Prognosis

LIU Guang-tao1，GUAN Feng-jun2，DONG Chen2

（1.Department of Pediatrics，the First People's Hospital，Changzhou 213000，Jiangsu，China;

2.Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract：Objective  To observe the expression of P-glycoprotein 170 in renal tissues of children with primary nephrotic syndrome， and to analyze the relationship between P-gp170 expression and clinical and pathological changes in renal tissues， and to investigate the expression of P-gp170 in GC-resistant children with PNS effect. Methods  Renal tissue samples from 96 children with PNS in different stages of disease were obtained by renal biopsy. The routine pathological diagnosis and quantitative analysis of renal pathology were performed.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detect the expression of P-gp170 protein and mRNA in renal tissues of children with PNS， and the expression of P-gp170 in different renal pathological types and pathological scores were compared.The expression of P-gp170 in renal tissue of children with PNS after GC and GC application was compared.Results  ①There was a certain amount of P-gp170 expression in normal kidney，The GC group was significantly higher than the normal control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.②The positive expression of P-gp170 was higher than the pathological score，the difference was statistically significant （P<0.05）.The expression of P-gp170 was different in different pathological types. The expressions of focal segmental sclerosis （FSGS）， membranous nephropathy （MN） and sclerosing nephropathy （SGN） were higher. There was no significant difference between the two groups （P>0.05）. The expressions of microscopic lesions （MCD） and mesangial proliferative （MsPGN） were lower，the difference was not statistically significant （P>0.05）. The difference between the first three and the latter two was statistically significant （P<0.05）.③The expression of P-gp170 in renal tissue of children with NS after GC was lower than that of patients with GC， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  The expression of P-gp170 in renal tissue of PNS children may be related to nephropathy. Renal P-gp170 can be combined with pathological type and degree of pathological injury to predict GC reactivity in different children. The increased expression of P-gp170 may be related to the activity and recurrence of PNS， and can be used as a predictor of prognosis.

Key words：Neph rotic syndrome;P-glycoprotein 170;Glucocorticoid;Drug resistance;Children

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是儿童时期较为常见的一种肾脏疾病，其主要治疗药物为糖皮质激素（glucocorticoid，GC），研究表明[1]，同一病理改变的不同肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）患儿对GC反应不同，不同病理类型对GC反应存在显著差异。而初始GC不足的患儿往往后来表现对GC不敏感，另有一部分最初对GC敏感，GC应用一段时间后，出现对GC抵抗，或反复复发。我们前期研究发现[2]，GC敏感和GC耐药PNS患儿肾组织存在P-糖蛋白170（P-glycoprotein170，P-gp170）表达的差异，GC 耐药PNS患儿存在肾脏原位P-gp170的过度表达，推测P-gp170肾组织的表达异常可能是一个新的病理生理环节，参与了PNS的GC耐药的发生。本研究分析P-gp170的表达与临床GC反应性指标间的关系，旨在揭示PNS耐药发生机制。

1资料与方法

1.1一般资料  选择2013年1月～2015年6月在常州市第一人民医院儿科住院的符合原发性NS诊断标准的患儿96例，男57例，女39例，年龄2～12岁，平均年龄（7.48±0.63）岁，无阳性家族史。本研究经我院经伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。依据肾穿刺的时间将病例分为：未用GC治疗者;GC应用半年内未复发者;反复复发，病程一年内者;随访时间1年。对照组肾组织为在我院泌尿外科住院的10例因外伤肾切除的组织，对照组患儿男6例，女4例，年龄6岁5个月～12岁9个月，平均年龄（9.62±0.78）岁，这些患儿既往无肾脏疾病病史;血压、血常规、尿常规及肝肾功能均正常;取肾组织前4周无感染、过敏性疾病、服药史;肉眼和光学显微镜下观察肾组织无病理学异常改变。PNS患儿与对照组的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2观察指标

1.2.1病理指标  包括肾脏病理类型及肾脏病理积分及肾组织P-gp170蛋白及mRNA的表达。其中肾小球病理评分标准为：①系膜细胞增殖：按无、轻、中、重度增殖分别记0，1，2和3分。②基质增宽：正常，记0分;轻度变化呈节段性增宽，毛细血管袢无明显影响，记1分;中度变化呈弥漫性增宽，<50%毛细血管袢狭窄闭锁，记2分;重度变化呈弥漫性增宽，>50%毛细血管袢狭窄闭锁，记3分。③硬化改变：正常，记0分;局灶节段分布，硬化肾小球<30%，记1分;硬化肾小球>30%～60%，记2分 ;硬化肾小球>60%，记3分。④新月体或纤维形成：正常（无形成），记0分;呈局灶节段分布<25%，记1分;弥漫性节段分布25%～50%，记2分;弥漫性灶性分布>50%，记3分。

1.2.2临床观察指标  应用GC者均为初始口服强的松2 mg/（kg·d），按正规疗程减量。

1.3主要试剂  P-gp170鼠抗人单克隆抗体（Sigma公司，批号200601）;免疫组化试剂盒（Sigma公司，批号2005BA0131）;多药耐药基因原位杂交检测试剂盒（MDR ISH Detection Kit）， 产品目录号：MK1153，针对人MDR1靶基因的mRNA序列为：①5'-ATGCT GGTGT TCGGA TACAT GACAG ATAGT TTTAC-3';②5'-CTGCC TATGA  AATCT TCAAG  ATAAT TGATA ATGAG-3';③5'-TGCTG CTTGT TTCCG GTTCG GTGCC TACTT GGTGG-3'。

1.4方法和步骤

1.4.1肾组织常规染色  肾组织取出后，进行免疫组化检测和常规染色，电镜检查由电镜室报告检验结果。2周内进行杂交实验，按照说明书进行。

1.4.2肾组织免疫组化测定  肾组织石蜡切片，脱蜡，脱水，灭活，蒸馏水洗涤，修复抗原，蛋白酶K消化，PBS洗涤，封闭，加一抗（1∶100），4 ℃过夜，同时做阴性对照。PBS洗涤，加二抗，37 ℃放置30 min。PBS洗涤，滴加链亲和素-过氧化酶溶液，37 ℃孵育，PBS洗涤，DAB显色，蒸馏水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.4.3肾组织原位杂交测定p-gp170mRNA表达  室温处理玻片，蒸馏水洗涤，胃蛋白酶，37 ℃消化。原位杂交用 PBS洗涤，后固定，预杂交，杂交：按每张切片20 μl杂交液，杂交后过夜，洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，原位杂交用PBS洗涤，滴加SABC，PBS洗涤。滴加生物素化过氧化物酶，PBS洗涤，DAB显色，脱水，二甲苯透明，封片。

1.4.4肾病理定量分析方法  按中南大学湘雅二院小儿肾脏病研究室吴小川等[3]所制定的小儿紫癜性肾炎病理定量分析方法进行，分别对肾小球与肾小管-间质的病理改变进行半定量评分。

1.4.5免疫组化及原位杂交结果观测  在光学显微镜下以及应用IBAS2000图像分析系统（德国OPTON公司）对免疫反应物进行观察，测定每个观察视野（×100）A 區域（肾小球、肾小管和间质）的辉度（GA）、阳性产物α相的辉度（Gα）及面积密度（AAα），按公式计算观察视野中的P-gp170阳性单位（PU）值。PU=100×∣Gα-GA∣/[（1-AAα）·Gmax]，其中Gmax为仪器的最大辉度值。

1.5统计学分析  采用SPSS 13.0软件进行分析，所有资料均采用（x±s）表示;所有数据分析之前都进行方差齐性检验。多组资料间和同组多个时点资料间比较，方差齐者，采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐者，采用Kruskal-Wallis分析，组间两两比较采用Mann-Whitney法，各参数间的相关性分析采用Mann-Whitney线性相关及Spearman等级相关分析;以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01 为统计学意义显著。

2结果

2.1各组肾组织中P-gp170的表达特点  对照组肾小球固有细胞无阳性信号，肾小管和肾间质均有P-gp170mRNA和蛋白的表达;PNS各组患儿P-gp170的表达分布与正常对照基本相同，但各部位阳性信号明显高于对照，差异有统计学意义（P<0.05）;初发未用GC者、初发应用GC治疗半年未复发者、反复复发<12个月者各组比较，未用GC与其它各组比，差异有统计学意义（P<0.05）;应用GC 两组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1～表4。

2.2不同肾脏病理积分P-gp170表达比较  肾脏病理积分较高者P-gp170表达阳性率较病理积分低者增多，差异有统计学意义（P<0.05），肾小管间质损害重者P-gp170的表达量增高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1～表3。

2.3不同肾脏病理类型P-gp170表达比较  反复复发者不同病理类型P-gp170的表达有差异，局灶节段硬化和膜性肾病、硬化性肾炎表达较高，微小病变肾病和系膜增生性表达最低，前三者与后两者比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

3讨论

PNS的GC耐药是涉及多因素、多步骤的病理过程，GC的反应性影响着PNS的转归。临床研究发现[4]，肾脏病理组织学不同，对GC的反应往往不同;此外，治疗方式也与GC耐药有关[5]。近年研究发现MDR1基因和P-gp170与多种临床和病理指标密切相关[6]。GC的应用可影响P-gp170的表达，进而影响GC的疗效[7]。

本实验中发现，P-gp170在正常人肾脏组织中即有一定量的表达，而PNS患儿肾组织P-gp170的表达增高，提示该因子表达异常可能与肾脏病变有关。以往有学者在白血病的研究[8]中得出了类似的结论：某些P-gp170高表达患者在化疗前已存在原发耐药，对化疗不敏感，疗效较差，故P-gp170可作为白血病预测预后的指标。我们认为，这部分患儿GC治疗前即有P-gp170表达增高，说明他们本身即可能存在原发GC耐药。P-gp170是人类MDR1基因产物，MDR1是与多药耐药相关的最重要基因，亦证实NS肾组织细胞具有内源性 MDR1 特性，存在一定的天然耐药性。因此，检测病人的MDR1可能为临床提供一个有意义的指标。

本研究发现，不同病理类型P-gp170表达存在差异，因而我们推测，PNS患儿肾活检同时若行P-gp170的检测，P-gp170表达量的高低可反映GC的疗效，低表达的病理类型对GC治疗敏感;反之，高表达者对GC治疗抵抗。这与病理类型表现为微小病变型和系膜增生型肾小球肾炎的患儿对GC的疗效优于膜性肾病、硬化性肾病的临床结果相似[9]。但本实验选择的病例数较少，尤其是硬化型者较少，故本实验的结果尚有待于进一步证实。而病理积分与P-gp170表达的关系表明病理损伤越重，P-gp170表达水平越高，GC耐药的几率增加。故我们推测P-gp170表达水平与病理损伤的程度有某种关联，可能由于病理损伤致P-gp170表达进一步增高，也可能由于炎症介质表达增多而促进了P-gp170表达增多，从而介导耐药。

研究表明[10]，耐药的产生可以出现在治疗前，称为原发性耐药或内在性耐药;也可以在治疗过程中逐渐出现或复发后出现，称为获得性耐药或继发性耐药，本研究结果与上述多种疾病的耐药背景相似。因此我们推测，MDR1基因及表达产物与GC互相作用，相互拮抗在PNS继发耐药中发挥了重要的作用。P-gp170的高表达可导致病人GC耐药，GC用量引发了P-gp170的表达改变，从而导致GC耐药;因而，监测P-gp170的表达变化有助于对患者GC疗效的判断。

综上所述，P-gp170在PNS患儿肾组织的表达与肾病病损有关，可结合病理类型和病理损伤程度同时检测肾组织P-gp170来预测不同患儿GC反应性; P-gp170的表達增高可能与NS活动和复发有关，可作为临床预测预后的指标。

参考文献：

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