髓核组织高温相关丝氨酸蛋白酶A1表达水平与椎间盘退变程度的相关性

李大鹏，吴 燕，岳佳伟，孙继芾，王家伦，黄永辉

1江苏大学 附属医院骨外科，江苏镇江 212001 2江苏大学 医学院生理学教研室，江苏镇江 212013

·论著·

髓核组织高温相关丝氨酸蛋白酶A1表达水平与椎间盘退变程度的相关性

李大鹏1，吴 燕2，岳佳伟2，孙继芾1，王家伦2，黄永辉1

1江苏大学 附属医院骨外科，江苏镇江 2120012江苏大学 医学院生理学教研室，江苏镇江 212013

目的分析髓核组织高温相关丝氨酸蛋白酶A1(HtrA1)的表达水平与椎间盘退变程度(Pfirrmann分级)的相关性。方法36例需手术摘除髓核组织的患者，术前行磁共振成像检查，据矢状位T2加权相磁共振对拟手术节段予Pfirrmann分级；采用逆转录PCR及Western blot方法检测髓核组织中HtrA1的mRNA及蛋白表达水平，对髓核组织HtrA1的表达水平与Pfirrmann等级进行相关性分析。结果36例椎间盘经磁共振成像检查，Pfirrmann Ⅰ级3例、Ⅱ级10例、Ⅲ级11例、Ⅳ级7例、Ⅴ级5例；髓核组织HtrA1 mRNA及蛋白表达水平随Pfirrmann等级增高而增加，经Bonferroni检验，除Ⅳ、Ⅴ级间外(P>0.05)，余各级间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，经Spearman秩相关分析：HtrA1 mRNA及蛋白表达水平与Pfirrmann分级间存在秩相关关系(P<0.000 1)。结论髓核组织HtrA1 mRNA及蛋白表达水平随Pfirrmann等级增高而升高，提示HtrA1与椎间盘退变程度存在相关性。

椎间盘退变；髓核；磁共振成像；Pfirrmann分级

下腰痛是脊柱外科临床上一个常见的问题，约80%的人在其一生中会出现下腰痛的表现[1- 2]，其最常见原因是腰椎间盘退变[3]，椎间盘退变始于髓核，髓核细胞数量减少及功能降低，导致聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原等细胞外基质合成减少及降解加快，进而导致髓核组织脱水、裂隙形成、凝胶状态的消失[4- 5]。椎间盘退变程度常采用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)Pfirrmann分级[6- 7]进行评估，Pfirrmann分级综合评估髓核、纤维环信号强度及椎间盘高度等因素，退变程度由轻到重分为Ⅰ～Ⅴ级。高温相关丝氨酸蛋白酶A1(high temperature requirement serine protease A1，HtrA1)是一种具有热休克蛋白性质的膜丝氨酸蛋白酶，有研究显示HtrA1在骨性关节炎、类风湿关节炎中的关节软骨组织表达升高，能促进软骨基质的降解[8- 9]，另有研究显示HtrA1能促进椎间盘退变的发生发展[10]，但HtrA1的表达水平与椎间盘退变程度的相关性研究较少。因此，本研究主要分析髓核组织HtrA1的表达水平与椎间盘Pfirrmann等级的相关性。

资料和方法

髓核组织来源2015年7月至2016年6月，江苏大学附属医院骨外科36例住院患者需手术取出椎间盘髓核组织，其中男性21例、女性15例；年龄18～80岁，平均(59.6±13.1)岁；手术节段：L1/2椎间盘 2例、L2/3椎间盘1例、L3/4椎间盘4例、L4/5椎间盘18例、L5/S1椎间盘11例。诊断：3例患者为腰椎爆裂性骨折，余33例患者为椎间盘退变性疾病(椎间盘突出、椎管狭窄等)，均排除椎间隙感染、结核、肿瘤等疾病。本研究已经江苏大学附属医院医学伦理委员会审批，并与患者签订知情同意书。

材料Trizol(Invitrogen公司)、逆转录试剂盒(Toyobo公司)、PCR扩增试剂盒(Promega公司)、DNA Marker(TaKaRa公司)、HtrA1引物(上海生工生物工程有限公司)、β-actin引物(上海生工生物工程有限公司)、细胞裂解液(南通碧云天生物技术研究所)、HtrA1抗体(Santa Cruz公司)、β-actin抗体(Santa Cruz公司)、羊抗兔二抗(Rockland公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(南通碧云天生物技术研究所)、辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)化学发光检测试剂盒(Millipore公司)、蛋白Marker(Invitrogen公司)、聚偏二氟乙烯膜(Roche公司)。

MRI检查36例患者术前均行MRI检查，常规腰椎矢状位T2加权相参数：快速自旋回波序列：重复时间3500 ms，回波时间99.0 ms，层厚 4.0 mm，层数11，视野280 mm。2名脊柱外科医师各自独立对拟手术节段椎间盘进行Pfirrmann分级(图1)，当分级结果不一致时，由2名专家共同讨论取得一致意见。

逆转录PCR检测髓核组织HtrA1mRNA水平髓核组织取出后，眼科剪仔细将内层纤维环组织去除，冲洗去除血污，将组织剪碎，液氮研磨，加入1 ml Trizol提取RNA；严格按试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA；cDNA行PCR扩增，引物序列见表1，反应条件如下：HtrA1：94℃ 3 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 7 min。β-actin：94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃ 7 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，0.5 μg/ml EB DNA染液染色，采集图像后，应用凝胶成像分析系统分析条带，得到所检测目的基因的像素强度值。

A.Pfirrmann Ⅰ 级(箭头)；B.Pfirrmann Ⅱ 级(箭头)；C.Pfirrmann Ⅲ 级(箭头)；D.Pfirrmann Ⅳ 级(箭头)；E.Pfirrmann Ⅴ 级(箭头)

A.Pfirrmann grade Ⅰ(arrow)；B.Pfirrmann grade Ⅱ(arrow)；C.Pfirrmann grade Ⅲ(arrow)；D.Pfirrmann grade Ⅳ(arrow)；E.Pfirrmann grade Ⅴ(arrow)

图1矢状位磁共振成像T2加权相Pfirrmann分级

Fig1Pfirrmann grading according to the sagittal T2 weighted magnetic resonance imaging

表 1 逆转录PCR相关基因引物及大小Table 1 Sequences of primers used in reverse transcription-polymerase chain reaction

HtrA1：高温相关丝氨酸蛋白酶A1

HtrA1：high temperature requirement serine protease A1

Westernblot检测髓核组织HtrA1蛋白水平髓核组织取出后，眼科剪仔细将内层纤维环组织去除，冲洗去除血污，将组织剪碎，细胞裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度，蛋白样品置于1.5 ml EP管中，加入等体积2×上样缓冲液，煮沸5 min；10%丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，聚偏二氟乙烯膜Tris HCl缓冲盐溶液/吐温20漂洗，3%牛血清白蛋白封闭，兔抗HtrA1抗体(1∶ 200)4 ℃孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG (1∶ 10 000)室温孵育1 h，加入HRP发光底物，成像分析系统成像并分析光密度值。

统计学处理应用SAS 10.0统计学软件进行统计分析，计算Kappa统计量评价两名阅片者阅片结果的一致性；髓核组织HtrA1 mRNA及蛋白表达水平与Pfirrmann等级的相关性采用Spearman相关分析；各Pfirrmann等级组间HtrA1表达水平差异比较采用ANOVA方差分析，各组间两两比较采用Bonferroni检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

MRI结果36例椎间盘术前MRI检查结果：Pfirrmann Ⅰ级3例、Ⅱ级10例、Ⅲ级11例、Ⅳ级7例、Ⅴ级5例，经Kappa检验，两名阅片者阅片结果具有极佳一致性(k=0.832)。

髓核组织HtrA1mRNA表达水平与Pfirrmann等级的相关性髓核组织HtrA1 mRNA表达水平随Pfirrmann等级增高而增加，经ANOVA方差分析，各等级mRNA表达水平不全等或全不等(F=97.51，P<0.0001)；经Bonferroni检验，除Ⅳ、Ⅴ级间外(P>0.05)，余各级间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)(图2、3)。经Spearman秩相关分析，HtrA1 mRNA表达水平与Pfirrmann分级间存在秩相关关系(P<0.000 1，相关系数rs=0.935 96)(图3)。

髓核组织HtrA1蛋白表达水平与Pfirrmann等级的相关性髓核组织HtrA1蛋白表达水平随Pfirrmann等级增高而增加，经ANOVA方差分析，各等级mRNA表达水平间差异有统计学意义(F=52.37，P<0.000 1)；经Bonferroni检验，除IV、V级间外(P>0.05)，余各级间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)(图4、5)。经Spearman秩相关分析，HtrA1蛋白表达水平与Pfirrmann分级间存在秩相关关系(P<0.000 1，相关系数rs=0.941 13)(图5)。

讨 论

椎间盘由外层的纤维环、中央的髓核以及上下软骨终板组成[11]，椎间盘退变过程中，髓核组织中聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原合成减少而降解加快，导致髓核内水含量减少，并逐渐失去原有的凝胶样形态，髓核纤维化并逐渐与纤维环分界不清，髓核凝胶状态的消失使其缓冲负荷的能力下降，进而出现纤维环撕裂、椎间盘高度下降等病理改变。椎间盘退变病理过程中，髓核组织的结构、功能的改变占主导及关键地位[11]，因此，本研究选择髓核而非纤维环、终板作为研究对象。

图2Pfirrmann各级HtrA1 mRNA表达水平

Fig2The mRNA expression of HtrA1 in different Pfirrmann grade groups

aP=0.014 9；bP<0.000 1；cP<0.0001

图3HtrA1 mRNA表达水平与Pfirrmann等级的相关性

Fig3Correlation between mRNA expression of HtrA1 and Pfirrmann grade

Mr：相对分子质量

Mr：relative molecular mass

图4Pfirrmann各级HtrA1蛋白表达水平

Fig4Protein expression of HtrA1 in different Pfirrmann grade groups

aP=0.0160；bP<0.0001；cP<0.0001

图5HtrA1蛋白表达水平与Pfirrmann等级的相关性

Fig5Correlation between protein expression of HtrA1 and Pfirrmann grade

MRI是评价椎间盘退变程度应用最为广泛、最为精准的检查手段之一，能够反应椎间盘的水含量及形态学上的变化[12]。Pfirrmann等[13]根据MRI T2加权相上髓核信号强度、纤维环信号强度、髓核与纤维环界限、椎间盘高度等因素，将椎间盘退变分为Ⅰ～Ⅴ级，有研究显示Pfirrmann分级能够反应髓核组织在细胞水平的退变程度[14]，也有学者采用改良Thompson分级等其他方法评估椎间盘退变程度[15]，但是Pfirrmann分级评价椎间盘退变具有较高的可靠性[16- 17]，目前已成为评价椎间盘退变最常用的方法[18]，因此，本研究采用Pfirrmann分级评价椎间盘退变程度。

HtrA1最初在大肠杆菌中发现[19]，C端为HtrA家族特有的高度保守的胰酶样催化区域和PDZ区域，N端为胰岛素样生长因子结合蛋白区域和Kazal类型蛋白酶抑制剂结构域[20]。有研究显示，HtrA1在骨性关节炎、类风湿关节炎中的关节软骨组织中的表达升高，能促进软骨基质的降解，提示HtrA1在关节退变中发挥重要的调控作用[8- 9]。另外，日本学者研究认为HtrA1启动子内的单核苷酸多态性与椎间盘退变相关，没有G等位基因的人群更容易出现椎间盘退变[21]，由此看来，HtrA1在椎间盘退变的病理过程中可能发挥着重要作用。

本研究提取髓核组织总RNA及总蛋白，在基因及蛋白水平检测不同退变程度的椎间盘髓核组织中HtrA1表达的差异，结果显示髓核组织HtrA1 mRNA及蛋白表达水平随Pfirrmann等级增高而增加，除Pfirrmann Ⅳ、Ⅴ级间外，余各级间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示HtrA1与椎间盘退变程度存在相关性，退变越严重，HtrA1的表达越高，可能与椎间盘内细胞外基质的降解有关，后续研究将进一步探讨HtrA1与基质金属蛋白酶的表达是否存在关联。Pfirrmann Ⅳ、Ⅴ级间HtrA1的表达无差异(P>0.05)，考虑Ⅴ级退变的椎间盘内髓核细胞数量进一步减少，为成纤维细胞所取代，因此HtrA1的表达并未进一步提高。

近年来，有学者应用一种新的MRI成像技术-T2*成像评价椎间盘退变，通过T2*成像扫描，对图像进行处理分析，可以计算椎间盘某一区域的T2*值，从而量化评价椎间盘退变的程度[22- 26]。Schultz等[27]研究显示T2*值可反映椎间盘内生化改变，较Pfirrmann分级能更好地反映椎间盘胶原组织成分的变化，其诊断评价椎间盘退变的能力强于形态学分级。另外，本研究显示髓核组织中HtrA1的表达水平与Pfirrmann等级具有显著相关性，如利用T2*成像获得髓核区域的T2*值，那么，髓核组织HtrA1的表达水平是否与髓核区域的T2值相关性更强需要后期进一步研究证实。

综上，髓核组织HtrA1的表达水平与Pfirrmann等级相关，提示HtrA1在椎间盘退变病理过程中发挥着重要作用。但是，本研究也存在一些不足，例如，Pfirrmann Ⅰ级椎间盘仅有3例，原因在于相对正常的椎间盘来源十分困难，仅能通过年轻的骨折患者或新鲜尸体获取，Pfirrmann Ⅴ级椎间盘仅有5例，原因在于极度严重退变椎间盘患者数量较少，今后需加大样本量，进一步深入研究HtrA1表达在椎间盘退变中的作用。

[1] Li X，An HS，Ellman M，et al. Action of fibroblast growth factor- 2 on the intervertebral disc [J].Arthritis Res Ther，2008，10(2)：R48. doi：10. 1186/ar2407.

[2] Ye S，Ju B，Wang H，et al. Bone morphogenetic protein- 2 provokes interleukin- 18-induced human intervertebral disc degeneration [J].Bone Joint Res，2016，5(9)：412- 418. doi：10. 1302/2046- 3758. 59. BJR- 2016- 0032. R1.

[3] Zheng CJ，Chen J. Disc degeneration implies low back pain [J].Theor Biol Med Model，2015，12：24. doi：10. 1186/s12976- 015- 0020- 3.

[4] Hsieh AH，Twomey JD. Cellular mechanobiology of the intervertebral disc：new directions and approaches [J].J Biomech，2010，43(1)：137- 145. doi：10. 1016/j. jbiomech. 2009. 09. 019.

[5] Li Z，Yu X，Liang JQ，et al. Leptin downregulates aggrecan through the p38-ADAMST pathway in human nucleus pulposus cells [J].PLoS One，2014，9(10)：e109595. doi：10. 1371/journal. pone. 0109595.

[6] Yu LP，Qian WW，Yin GY，et al. MRI assessment of lumbar intervertebral disc degeneration with lumbar degenerative disease using the Pfirrmann grading systems [J].PLoS One，2012，7(12)：e48074. doi：10. 1371/journal. pone. 0048074.

[7] Emanuel KS，Vergroesen PP，Peeters M，et al. Poroelastic behaviour of the degenerating human intervertebral disc：a ten-day study in a loaded disc culture system [J].Eur Cell Mater，2015，29：330- 341.

[8] Grau S，Richards PJ，Kerr B，et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease [J].J Biol Chem，2006，281(10)：6124- 6129. doi：10. 1074/jbc. M500361200.

[9] Wu J，Liu W，Bemis A，et al. Comparative proteomic characterization of articular cartilage tissue from normal donors and patients with osteoarthritis [J].Arthritis Rheum，2007，56(11)：3675- 3684. doi：10. 1002/art. 22876.

[10] Akhatib B，Onnerfjord P，Gawri R，et al. Chondroadherin fragmentation mediated by the protease HTRA1 distinguishes human intervertebral disc degeneration from normal aging [J].J Biol Chem，2013，288(26)：19280- 19287. doi：10. 1074/jbc. M112. 443010.

[11] Daly C，Ghosh P，Jenkin G，et al. A review of animal models of intervertebral disc degeneration：pathophysiology，regeneration，and translation to the clinic [J].Biomed Res Int，2016，2016：5952165. doi：10. 1155/2016/5952165.

[12] 郭智萍，张旭静，朱瑾，等. 3. 0 T磁共振T2* mapping 成像诊断腰椎间盘退变 [J].中国医学影像技术，2013，29(11)：1849- 1852. doi：10. 13929/j. 1003- 3289. 2013. 11. 028.

[13] Pfirrmann CW，Metzdorf A，Zanetti M，et al. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration [J].Spine，2001，26(17)：1873- 1878.

[14] 杨勇，梁伟，罗卓荆，等. 不同Pfirrmann分级椎间盘内髓核细胞生物学特性的比较 [J].脊柱外科杂志，2011，9(4)：244- 248. doi：10. 3969/j. issn. 1672- 2957. 2011. 04. 014.

[15] Wang SZ，Jin JY，Guo YD，et al. Intervertebral disc regeneration using plateletrich plasmacontaining bone marrowderived mesenchymal stem cells：a preliminary investigation [J].Mol Med Rep，2016，13(4)：3475- 3481. doi：10. 3892/mmr. 2016. 4983.

[16] Videman T，Battie MC，Ripatti S，et al. Determinants of the progression in lumbar degeneration：a 5-year follow-up study of adult male monozygotic twins [J].Spine，2006，31(6)：671- 678. doi：10. 1097/01. brs. 0000202558. 86309.ea.

[17] Borthakur A，Maurer PM，Fenty M，et al. T1ρ MRI and discography pressure as novel biomarkers for disc degeneration and low back pain [J].Spine，2011，36(25)：2190- 2196. doi：10. 1097/BRS. 0b013e31820287bf.

[18] Rim DC. Quantitative Pfirrmann disc degeneration grading system to overcome the limitation of Pfirrmann disc degeneration grade [J].Korean J Spine，2016，13(1)：1- 8. doi：10. 14245/kjs. 2016. 13. 1. 1.

[19] Clausen T，Kaiser M，Huber R，et al. HTRA proteases：regulated proteolysis in protein quality control [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12(3)：152- 162. doi：10. 1038/nrm3065.

[20] Eigenbrot C，Ultsch M，Lipari MT，et al. Structural and functional analysis of HtrA1 and its subdomains [J].Structure，2012，20(6)：1040- 1050. doi：10. 1016/j. str. 2012. 03. 021.

[21] Urano T，Narusawa K，Kobayashi S，et al. Association of HTRA1 promoter polymorphism with spinal disc degeneration in Japanese women [J].J Bone Miner Metab，2010，28(2)：220- 226. doi：0. 1007/s00774- 009- 0124- 0.

[22] Chai JW，Kang HS，Lee JW，et al. Quantitative analysis of disc degeneration using axial T2 mapping in a percutaneous annular puncture model in rabbits [J].Korean J Radiol，2016，17(1)：103- 110. doi：10. 3348/kjr. 2016. 17. 1. 103.

[23] Zhang X，Yang L，Gao F，et al. Comparison of T1rho and T2* relaxation mapping in patients with different grades of disc degeneration at 3T MR [J].Med Sci Monit，2015，21：1934- 1941. doi：10. 12659/MSM. 894406.

[24] Sun W，Zhang K，Zhao CQ，et al. Quantitative T2 mapping to characterize the process of intervertebral disc degeneration in a rabbit model [J].BMC Musculoskelet Disord，2013，14：357. doi：10. 1186/1471- 2474- 14- 357.

[25] Ellingson AM，Mehta H，Polly DW，et al. Disc degeneration assessed by quantitative T2* (T2 star) correlated with functional lumbar mechanics [J].Spine，2014，38(24)：1533- 1540. doi：10. 1097/BRS. 0b013e3182a59453.

[26] Chen C，Jia Z，Han Z，et al. Quantitative T2 relaxation time and magnetic transfer ratio predict endplate biochemical content of intervertebral disc degeneration in a canine model [J].BMC Musculoskelet Disord，2015，16：157. doi：10. 1186/s12891- 015- 0610- 6.

[27] Schultz DS，Rodriguez AG，Hansma PK，et al. Mechanical profiling of intervertebral discs [J].J Biomech，2009，42(8)：1154- 1157. doi：10. 1016/j. jbiomech. 2009. 02. 013.

CorrelationbetweentheExpressionofHighTemperatureRequirementSerineProteaseA1inNucleusPulposusTissueandtheDegreeofIntervertebralDiscDegeneration

LI Dapeng1，WU Yan2，YUE Jiawei2，SUN Jifu1，WANG Jialun2，HUANG Yonghui1

1Department of Orthopaedics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212001，China2Department of Physiology，Medical College of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China

HUANG Yonghui Tel：0511- 85082239，Fax：0511- 85029089，E-mail：huangyh8855@163.com

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression level of high temperature requirement serine protease A1 (HtrA1) in nucleus pulposus and the degree of intervertebral disc degeneration (Pfirrmann grade).MethodsThirty-six patients who underwent excision of nucleus pulposus were examined by magnetic resonance imaging (MRI) before operation，and the Pfirrmann grading of all patients was performed according to the sagittal T2 weighted MRI.The expression of HtrA1 in nucleus pulposus tissue was detected by reverse transcription polymerase chain reaction and Western blot.The correlation between the expression level of HtrA1 in nucleus pulposus tissue and Pfirrmann grade was analyzed.ResultsMRI in all 36 patients showed that there were 3 cases of Pfirrmann grade Ⅰ，10 cases of grade Ⅱ，11 cases of grade Ⅲ，7 cases of grade Ⅳ，and 5 cases of grade Ⅴ.The mRNA and protein expressions of HtrA1 in nucleus pulposus tissue increased with the increase of Pfirrmann grade.There were significant differences in the expression level of HtrA1 among different Pfirrmann grade groups (P<0.05) except for the difference between grade Ⅳ and Ⅴ (P>0.05).Spearman rank correlation analysis revealed that there was a rank correlation between expression level of HtrA1 and Pfirrmann grade (P<0.000 1).ConclusionThe mRNA and protein expressions of HtrA1 in nucleus pulposus tissue increase with the increase of Pfirrmann grade，indicating HtrA1 is correlated with the degree of intervertebral disc degeneration.

intervertebral disc degeneration；nucleus pulposus；magnetic resonance imaging；Pfirrmann grading

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：737-742

国家自然科学基金(81601931)、江苏省自然科学基金(BK20150475)和镇江市重点研发计划-社会发展(SH2015085) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81601931)，Natural Sciences Foundation of Jiangsu Province (BK20150475)，and Key Research and Development Programs of Zhenjiang City (SH2015085)

黄永辉 电话：0511- 85082239，传真：0511- 85029089，电子邮件：huangyh8855@163.com

R681.5+3

A

1000- 503X(2017)06- 0737- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.001

2016- 10- 26)