链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病模型的影响因素

林燕超 吴佩文(通讯作者) 林东(通讯作者)

350000福建医科大学附属第一医院1 350000福建医科大学附属口腔医院2

链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病模型的影响因素

林燕超1吴佩文(通讯作者)1林东(通讯作者)2

350000福建医科大学附属第一医院1350000福建医科大学附属口腔医院2

目的：通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病的SD大鼠模型，观察给药剂量、给药次数对大鼠成模率、死亡率的影响。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(N组)及造模组(A、B、C组)，予高糖、高脂饲料喂养8周后，造模组分别给予链脲佐菌素(STZ)20 mg/kg单次腹腔内注射(A组)、20 mg/kg连续2 d腹腔内注射(B组)及30 mg/kg单次腹腔内注射(C组)，然后测空腹血糖。结果：A组成模率较低(33.3%)，死亡率0%；B组成模率较高(66.7%)，死亡率13.3%；C组成模率高(100%)，死亡率高(60.0%)。结论：高糖、高脂饲养8周后联合小剂量STZ 20 mg/kg连续2 d腹腔内注射组SD大鼠成模率较高，死亡率较低。

链脲佐菌素；动物模型；2型糖尿病；SD大鼠；血糖

构建2型糖尿病发病特点的动物模型，对于研究糖尿病的病因、发病机制、防治极其重要。目前国内外研究学者大多数用高糖、高脂膳食联合链佐脲菌素(STZ)诱导大鼠形成糖尿病模型的造模方法[1]。但相关文献对于以下问题报道各不相同：糖尿病大鼠判断标准、STZ注射方法、STZ注射次数、STZ注射剂量及高糖、高脂膳食饲养时间。本研究通过不同剂量、不同注射次数向SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素，从而诱导SD大鼠形成糖尿病，观察对SD大鼠的空腹血糖值的影响，研究建立2型糖尿病模型的最佳方法。

资料与方法

实验动物及饲养条件：清洁级SD雄性大鼠60只，体重180～220 g，购于福建医科大学实验动物中心，饲养于福建医科大学实验动物中心SPF级实验室。标准化饲养房笼子喂养，饲以高糖、高脂饲料，自由饮水。

仪器与试剂：pH计，上海梅特勒公司，DELLTA320。微量血糖测定仪和血糖试纸，强生公司美国生产。电子体重秤，大连星海电子衡器有限公司。枸橼酸缓冲液由福建医科大学附属第一医院中心实验室提供，0.1 mol/L，pH 4.3。链脲佐菌素(STZ)，100 mg瓶装，Sigma公司S-0130(分装)。新鲜配制成1%STZ溶液，装入无菌玻璃瓶中避光，备用(现配现用，配完20 min内使用完毕)。

分组及造模方法：大鼠适应性饲养1周后禁食12 h，根据体重随机分为4组：正常对照组(N组)、模型组A组(20 mg/kg STZ单次腹腔内注射)、模型组B组(20 mg/kg STZ连续2 d腹腔内注射)、模型组C组(30 mg/kg STZ单次腹腔内注射)，每组15只。第2周起予高脂、高糖饲料连续喂养8周，然后依不同试验组，腹腔注射STZ或枸橼酸缓冲液。腹腔注射前1 d禁食但不禁水12 h。正常对照组大鼠腹腔注射1 mL枸橼酸缓冲液。

观察指标及检测方法：①观察造模组大鼠进食量、饮水量、排尿量、一般状态及死亡情况。②于腹腔注射3 d、1周、2周、3周、4周行空腹血糖测定：大鼠禁食8 h后尾静脉采血，用微量血糖测定仪测空腹血糖，计算出SD大鼠成模率及死亡率。

糖尿病判断标准：注药后3 d测空腹血糖，≥16.7 mmol/L者选为糖尿病大鼠模型。

统计学方法：采用SPSS 20.0统计处理，计量资料采用(±s)表示，采用t检验；计数资料采用率(%)表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

成模状况：注射后3 d空腹血糖浓度≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。A组SD大鼠成模5只，在注射后无死亡。B组SD大鼠成模10只，在注射后死亡2只。C组SD大鼠成模15只，在注射后死亡9只。成模后的SD大鼠出现糖尿病典型的临床表现，即多饮、多食、多尿、体重下降，见表1。

空腹血糖检测结果：大鼠空腹血糖测试结果表明，注射后3 d A组、B组和C组大鼠血糖均明显高于注射前(P＜0.05)，而正常对照组注射前后血糖无明显变化(P＞0.05)。A组、B组和C组大鼠血糖均明显高于N组。注射后1周、2周、3周、4周检测血糖结果，A组、B组和C组SD大鼠血糖均保持在高水平状态，见表2。

一般情况：模型组大鼠在造模成功后逐渐出现典型的糖尿病症状：多饮、多食、多尿、消瘦、毛失去光泽、脱毛、活动减少和伤口易感染等。观察4周，模型组A、B、C组大鼠体重减轻15%，饮水量增加近200%。

讨 论

STZ作为一种广谱抗生素被研发出来，在运用过程中，具有抗肿瘤作用，但具有明显的胰岛毒性，通过特异性的损伤胰岛β细胞，从而使胰岛素合成减少，引发糖尿病。其为无色固体，易溶于水，但其水溶液稳定性差，且具有光敏性，故现配现用且避光使用[2]。2型糖尿病动物模型的胰岛素抵抗和糖耐量受损可以通过高糖、高脂饮食实现，而胰岛细胞破坏引起的胰岛素分泌相对不足一般采用STZ诱导[3]，故对2型糖尿病动物模型予高糖、高脂饮食后并予腹腔或静脉注射STZ来造模，从而表现出糖尿病典型临床症状，即多饮、多食、多尿、体重减轻、高血糖[4]。

表1 4组SD大鼠造模情况

糖尿病模型使用STZ注射的剂量差异明显，从15～65 mg/kg均有报道[5]。造成剂量差异巨大的原因可能如下：①高糖、高脂饲养SD大鼠的时间：高糖、高脂饲养的时间越长，动物体重越重，胰岛素抵抗越明显，胰岛负担越重，其所需的STZ每kg体重剂量减少，但总STZ剂量增多[6]。SD大鼠予高糖、高脂饲养时间越长，动物越肥胖，造成糖尿病模型后期并发症越多，因此，我们建议高脂、高糖饲养时间8周为宜。②SD大鼠空腹时间：空腹时间越长，机体对STZ越敏感，所需STZ的剂量越少[7]，但空腹时间过长，易引发低血糖，从而导致动物死亡率升高，因此，我们建议空腹时间12 h为宜。③STZ给药的次数：STZ对胰岛细胞有明显毒性，1次大剂量STZ注射，引起胰岛细胞大量死亡，从而诱发动物明显高血糖酮症死亡[8]；多次小剂量STZ注射，使胰岛细胞部分受损，仍然能分泌胰岛素[9]，但多次注射明显增加工作量，增加实验误差，且糖尿病动物抵抗力差，注射部位易诱发感染灶，从而增加死亡率。因此，依我们的实验结果，建议予20 mg/kg，连续2 d腹腔注射为宜。④目前STZ给药途径主要有尾静脉和腹腔注射两种。据相关报道，尾静脉注射所需剂量比腹腔注射要低，但是尾静脉注射操作技术要求较高[10]，因此，我们使用腹腔注射。⑤其他原因：如STZ的避光、低温、密封保存，糖尿病造模成功标准、STZ注射操作、STZ水溶液配置时间等。

为了提高造模成功率，降低大鼠死亡率，我们提出注意以下几个方面：①STZ要求在棕色瓶子避光保存，密闭防潮并置于-20℃的冰箱里，因其水溶液不稳定，故应现配现用，配置到注射过程中始终避光低温放置。②为保持SD大鼠良好的营养状态及较强的抵抗力，造模前大鼠体重应＞200 g。③注射STZ前大鼠应空腹12 h，有文献表明大鼠空腹时成模率明显高于非空腹时[11]，空腹时间越长者，STZ用量越少，但空腹时间过长，动物死亡率提高[9]，因此建议空腹12 h。④造模成功后大鼠多尿症状明显，故应勤换垫料，保持鼠笼清洁、干爽，防止感染。⑤造模后的糖尿病大鼠，因其抵抗力较差，测尾静脉时，其采血部位应消毒，并且保持鼠笼清洁、干爽[12]。⑥实验室保持适宜、恒定的温度和湿度，应注意通风，防止诱发肺炎等疾病，甚至造成死亡。

高糖、高脂饲养SD大鼠8周后予腹腔注射STZ造成2型糖尿病大鼠模型的方法，目前应用比较多，本研究予1次小剂量STZ 20 mg/kg，其成模率低，未见大鼠死亡；相较于STZ 30 mg/kg，其成模率100%，但大鼠死亡率60%。当予连续2 d腹腔注射小剂量STZ 20 mg/kg，造模成功率66.7%，死亡率低13.3%。依实验结果，建议予高糖、高脂饲养8周后联合小剂量STZ 20 mg/kg连续2 d腹腔内注射，SD大鼠成模率较高，死亡率较低。本实验为糖尿病的实验研究提供了一种适用的动物模型。

表2 4组SD大鼠空腹血糖检测结果(±s，mmol/L)

表2 4组SD大鼠空腹血糖检测结果(±s，mmol/L)

组别 注射前 注射后3 d 注射后1周 注射后2周 注射后3周 注射后4周A组 3.87±0.31 21.45±4.85 21.51±4.78 21.31±4.90 21.55±4.23 21.35±4.91 B组 3.78±0.45 22.50±6.25 22.55±6.38 22.45±6.60 22.53±6.23 22.57±6.51 C组 3.82±0.36 21.15±5.75 21.22±5.87 21.23±5.92 21.28±5.83 21.19±5.86 N组 3.92±0.42 3.98±0.35 3.76±0.45 3.95±0.39 3.90±0.40 3.87±0.43

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Influencing factors of streptozotocin induced diabetes mellitus in SD rats

Lin Yanchao1,Wu Peiwen(Corresponding author)1,Lin Dong(Corresponding author)2
The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University 3500001Stomatological Hospital Affiliated to Fujian Medical University 3500002

Fund projectYoung science foundation of National Natural Science Foundation of China:81400805;Fujian Natural Science Foundation:2016J449;Category B technology project of Fujian Provincial Education Department:JB12108

Objective:The SD rats model of type 2 diabetes mellitus were established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ),and we observed the effects of dose and number of administration on the rate of mold formation and mortality in rats.Methods:60 male SD rats were randomly divided into the normal control group(N)and the model group of A-C group.After feeding high glucose and high fat diet for 8 weeks,the model group was given streptozotocin(STZ)20 mg/kg single intraperitoneal injection(the A group),20 mg/kg continuous two days intraperitoneal injection(the B group)and 30 mg/kg single intraperitoneal injection(the C group),then fasting glucose was measured.Results:In A group,the molding rate was low(33.3%),and the mortality rate was 0%.In B group,the molding rate was higher(66.7%),and the mortality rate was 13.3%.In C group,the molding rate was high(100%),and the mortality rate was high(60%).Conclusion:After feeding high glucose and high fat diet for 8 weeks,combined with small dose of STZ 20 mg/kg continuous two days intraperitoneal injection,the molding rate of SD rats was higher,and the mortality rate was lower.

Streptozotocin;Animal model;Type 2 diabetes mellitus;SD rats;Blood sugar

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.35.2

国家自然科学基金青年科学基金项目，81400805；福建省自然科学基金：2016J449；福建省教育厅B类科技项目：JB12108