风味蛋白酶水解鸭骨工艺优化

刘光宪，祝水兰，周巾英，朱雪晶，冯健雄，*

(1.江西省农业科学院 农产品加工研究所，江西 南昌 330200； 2.江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室，江西 南昌 330022)

风味蛋白酶水解鸭骨工艺优化

刘光宪1，2，祝水兰1，周巾英1，朱雪晶1，冯健雄1，*

(1.江西省农业科学院 农产品加工研究所，江西 南昌 330200； 2.江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室，江西 南昌 330022)

为了实现鸭骨副产物的综合利用，以鸭骨为原料，通过测定酶解产物的抗氧化能力及水解度，确定最适用酶为风味蛋白酶。研究底物浓度、风味蛋白酶用量、酶解温度、pH、酶解时间5个因素对鸭骨蛋白水解度的影响。在单因素试验的基础上，通过正交试验确定鸭骨风味蛋白酶酶解的最佳工艺条件为：底物浓度2%，风味蛋白酶用量7 000 U·g-1，酶解温度45 ℃，pH值6.0，酶解时间5 h。在此条件下鸭骨蛋白的水解度为17.10%。

鸭骨；风味蛋白酶；水解度；正交试验

鸭骨是肉鸭加工过程中产生的主要副产品之一，约占鸭总重的8%～17%[1]。鸭骨的主要成分有水分、粗蛋白、矿物质和脂肪，其中，蛋白质的含量较高[2]，其氨基酸组成及比例、疏水性与鸭骨在加工生产过程中的特征风味有很大关系[3]。鸭骨蛋白水解液含有构成蛋白质的所有氨基酸，包括人体所需多种必需氨基酸[4]，具有很高的营养价值和功效；然而，由于缺乏合理可行的加工技术及配套设备，目前鸭骨加工利用程度较低，附加值不高。鸭骨的高值化加工利用是鸭肉加工中亟待解决的问题[5]。

生物酶解技术具有高效、反应温和、对氨基酸结构影响小等优点[6]，被广泛用于制备蛋白肽，但不同的酶由于具有不同的酶切点，因此，酶解产物亦不尽相同，营养价值和风味各异[7]。目前，禽骨酶解多采用碱性蛋白酶[4]，该酶具有较好的水解度，但酶解液存在不同程度的苦味问题。相关研究表明，风味蛋白酶能有效水解苦味肽，可减少或去除肽的苦味[8-9]；因此，风味蛋白酶或许可以代替碱性蛋白酶应用于禽骨蛋白酶解中，克服碱性蛋白酶酶解带来的问题。

近年来，关于鸭骨的精深加工研究，多限于鸭骨的主要成分分析、氨基酸组成分析，以及鸭骨糜、骨粉等初级产品的加工等方面[4,10-11]，关于不同酶制剂对鸭骨酶解的效果，及活性肽制备工艺优化等的研究较少。本文对比几种蛋白酶在鸭骨酶解方面的效力，筛选出最佳酶制剂，并对酶解条件进行优化，为鸭骨的加工利用研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

新鲜鸭骨，由江西煌上煌集团食品股份有限公司提供。碱性蛋白酶(2.4 AU·g-1)、复合蛋白酶(1.5 AU·g-1)、中性蛋白酶(1.5 AU·g-1)和风味蛋白酶(1.0 AU·g-1)购于丹麦诺维信公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼购于Sigma公司；无水乙醇、水杨酸等试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；XL-200A型粉碎机，上海润实电器有限公司；B-260型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；TP-214型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；TGL-10C型高速台式离心

机，上海安亭科学仪器厂；KDY-9820型凯氏定氮仪，北京市通润源机电技术有限责任公司；SynergyHT型多功能酶标仪，美国BioTek公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鸭骨架处理

剔除骨架上残留的肉、脂肪、皮等非骨物质，清洗、破碎后于125 ℃高压蒸煮60 min。将软化后的鸭骨去油脂，烘箱中50 ℃烘干6 h，利用高速组织捣碎机粉碎，过60目筛，分装，置于-18 ℃冰箱中冷冻备用。试验前解冻鸭骨粉，取一定量的鸭骨粉于烧杯中，超纯水加热溶解，用NaOH标准溶液调节反应体系至所需的pH值。

1.2.2 鸭骨粉蛋白含量测定

参照GB 5009.5—2010，凯氏定氮法测定鸭骨粉蛋白质含量，其蛋白含量为24.8%±0.4%。

1.2.3 蛋白酶筛选

将鸭骨粉配制成蛋白质含量为 20 mg·mL-1的溶液，加酶酶解，酶的种类及酶解条件见表1。酶解后，沸水浴灭酶10 min，7 500 r·min-1离心10 min，取上清液测定DPPH自由基、羟基自由基清除率及水解度，筛选出最佳蛋白酶。

1.2.4 抗氧化能力测定

DPPH清除能力测定。参照Brand-William等[12]的方法，稍作修改。用95%乙醇配制0.2 mmol·L-1DPPH溶液，取100 μL酶解液与100 μL DPPH溶液于96孔酶标板混合均匀，常温避光反应30 min，517 nm处测定吸光值D1。以100 μL 95%乙醇代替DPPH溶液与100 μL去离子水反应为空白组，测定吸光值D0；以100 μL DPPH溶液与100 μL去离子水反应为对照组，测定吸光值D2。DPPH·清除率(EDPPH)计算公式如下：

EDPPH/%=(D2-D1)/(D2-D0)×100。

(1)

羟自由基清除能力测定。根据刘晶晶等[13]

表14种酶的酶解条件

Table1Hydrolytic conditions of enzymes

酶EnzymeSC/%EA/(U·g-1)pHT/℃t/h碱性蛋白酶Alkalineprotease2600080554中性蛋白酶Neutralprotease2600070504风味蛋白酶Flavourzyme2600060504复合蛋白酶Compoundprotease2600070504

SC，底物浓度；EA，加酶量；T，酶解温度；t，酶解时间。

SC， Substrate concentration; EA， Enzyme amount;T， Reaction temperature;t， Reaction time.

的方法，取1.0 mL酶解液，依次加入2 mL 1.8 mmol·L-1FeSO4、1.5 mL 1.8 mmol·L-1水杨酸-乙醇和0.1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2，37 ℃水浴30 min。反应结束后取200 μL混合液于96孔酶标板，使用酶标仪在510 nm处测定吸光值Di，以去离子水代替样品液的吸光值为DCK，羟自由基清除率(E)计算公式如下：

E/%=(DCK-Di)/DCK×100。

(2)

1.2.5 水解度测定

以游离氨基酸的测定为参照，利用Nielsen等[14]的方法，测定游离氨基酸的含量。取0.2 mL样品溶液，加入4 mL邻苯二甲醛试剂，室温反应2 min后立即于340 nm处测吸光值，以去离子水替代样品溶液作空白对照。

水解度(%)=(水解后溶液的游离氨基含量-水解前游离氨基含量)/总氨基含量×100。

1.3 酶解工艺研究

1.3.1 单因素试验

以筛选出的最适酶为材料，以水解度为指标进行单因素试验，分别研究底物浓度(2%、4%、6%、8%、10%、12%)，酶解温度(35、40、45、50、55 ℃)、反应pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、酶解时间(1、2、3、4、5、6 h)、酶添加量(4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U·g-1)对鸭骨粉水解度的影响。

1.3.2 正交试验

根据单因素试验结果，设计正交试验，确定最佳酶解工艺条件。

1.4 数据统计分析

所有试验重复3次。试验数据采用Origin 2017软件作图，在SPSS 17.0软件平台上进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶筛选

4种蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶)对鸭骨均具有较好的水解性(图1)，其中，碱性蛋白酶、风味蛋白酶制备的鸭骨肽的抗氧化活性略高于其他蛋白酶制备的鸭骨肽，但碱性蛋白酶制备的鸭骨肽具有苦味，而风味蛋白酶制备的鸭骨肽没有苦味。综上，选取风味蛋白酶作为本试验的水解酶，这与丁安子等[15]的研究报道相一致。

2.2 单因素试验

2.2.1 底物浓度对鸭骨蛋白酶解的影响

如图2所示，随着底物浓度增大，水解度呈下降趋势。当底物浓度为2%时，水解度最大。当底物浓度在2%～6%之间时，水解度无显著变化(P>0.05)；当底物浓度高于6%，其水解度显著(P<0.05)降低。这可能是因为底物浓度过大导致水解液黏度过大，影响酶的扩散，从而抑制了酶解反应。因此，选择2%的底物浓度较为合适。

不同处理无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。下同Treatments followed by no same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below图1 4种蛋白酶的鸭骨水解度及其产物的抗氧化活性Fig.1 Hydrolysis degree of duck bone under 4 proteases on antioxidant activity after hydrolyzation

图2 底物浓度对鸭骨蛋白酶解的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on proteolysis of duck bone

2.2.2 风味蛋白酶用量对鸭骨蛋白酶解的影响

从图3可以看出，随着风味蛋白酶用量增加，鸭骨蛋白的水解度显著(P<0.05)增加。这可能是因为酶解反应初期，底物与酶的相互作用未达到饱和。当酶加入量超过7 000 U·g-1时，水解度不再显著增加，此时反应达到平衡。

2.2.3 酶解温度对鸭骨蛋白酶解的影响

如图4所示，水解度随着酶解温度的增加先显著增大(P<0.05)后显著(P<0.05)减小，酶解温度达到45 ℃时，水解度最大。这可能是因为在45 ℃以下时，随着酶解温度增加，体系内能逐渐增大，酶与底物之间的接触面积增大，反应速度加快，即酶催化能力增强，酶活力增大。然而，酶是一种生物活性蛋白，当其所处的环境温度高于某个点时，酶蛋白的特定结构会发生改变，酶的活性也会降低，直至完全失活，即当酶解温度大于45 ℃时，酶的活性开始下降，引起水解度随之降低。

图3 风味蛋白酶用量对鸭骨蛋白酶解的影响Fig.3 Effect of enzyme amount on proteolysis of duck bone

2.2.4 pH值对鸭骨蛋白酶解的影响

从图5可见，随着pH值的增大，水解度先显著(P<0.05)增加。当pH值为6.0时，水解度达到最大。之后，水解度较pH值为6.0时显著(P<0.05)降低。

2.2.5 酶解时间对鸭骨蛋白酶解的影响

从图6可以看出，当酶解时间在1～5 h之间时，随酶解时间延长，水解度显著(P<0.05)增加，之后不再显著增长。这可能是因为反应时间在5 h以内时，鸭骨蛋白呈饱和状态，遵循零级反应，反应向着产物生成的方向进行，水解度不断增加，当酶解时间达到5 h以后，反应进入平衡点，水解度达到最大值。

图5 pH对鸭骨蛋白酶解的影响Fig.5 Effect of pH on proteolysis of duck bone

图6 酶解时间对鸭骨蛋白酶解的影响Fig.6 Effect of reaction time on proteolysis of duck bone

2.3 正交试验

影响蛋白水解的各因素并不是孤立的，它们之间是相互关联的。鸭骨的酶解反应必须考虑到风味蛋白酶用量、底物浓度、酶解温度、体系pH值及酶解时间等的影响[16]。鉴于当底物浓度为2%～6%时，鸭骨蛋白水解度受底物浓度的影响较小，故固定底物浓度为2%，选择酶解温度(A)、反应时间(B)、风味蛋白酶用量(C)、pH值(D)4个因素进行4因素3水平的正交试验，以水解度为指标，确定最佳工艺条件。正交试验各因素水平设置见表2。

正交试验结果如表3所示。影响水解度的各因素依次为风味蛋白酶用量>pH值>酶解时间>酶解温度。以水解度为指标时，制备鸭骨肽的最佳工艺组合为A2B3C3D2，即酶解温度45 ℃，底物浓度2%，酶解时间5 h，风味蛋白酶用量7 000 U·g-1，pH值6.0。在此工艺条件下，蛋白水解度为17.10%。

表2正交试验因素水平表

Table2Orthogonal factors design

水平LevelA/℃B/hC/(U·g-1)D140350005524546000603505700065

表3正交试验结果

Table3Results of orthogonal experiment

试验序号No．ABCD水解度Hydrolysisdegree/%111111277212221670313331621421231473522311621623121571731321621832131424933211571k115227145701424014897k215550157171571316207k315387158771621015060R0323130719701310

3 小结

本研究对比了4种蛋白酶(碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶)对鸭骨肽水解度、抗氧化活性的影响，筛选出最佳酶制剂为风味蛋白酶。在单因素试验的基础上采用正交试验，获得鸭骨肽的最佳酶解工艺为：酶解温度45 ℃，底物浓度2%，酶解时间5 h，风味蛋白酶用量7 000 U·g-1，pH值6.0。在此条件下，鸭骨蛋白的水解度为17.10%。

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Optimizationofduckboneenzymolysisbyflavourzyme

LIU Guangxian1，2， ZHU Shuilan1， ZHOU Jinying1， ZHU Xuejing1， FENG Jianxiong1，*

(1.InstituteofAgriculturalProductsProcessing，JiangxiAcademyofAgriculturalSciences，Nanchang330200，China; 2.KeyLaboratoryofFunctionalSmallOrganicMolecule，MinistryofEducation，JiangxiNormalUniversity，Nanchang330022，China)

To comprehensively utilize the byproduct of duck bone， duck bone was selected as the study object. By measuring the antioxidant activity and hydrolysis degree， it was confirmed that the flavourzyme was the optimal enzyme. The effects of substrate concentration， enzyme amount， reaction temperature， pH value and reaction time on duck bone hydrolyzation were studied. Futhermore， the optimal process for duck bone hydrolyzation was obtained by orthogonal test as follows: substrate concentration 2%， enzyme amount 7 000 U·g-1， reaction temperature 45 ℃， pH value 6.0， and reaction time 5 h. Under this condition， the hydrolysis degree of duck bone reached 17.10%.

duck bone; flavourzyme; hydrolysis degree; orthogonal test

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2128-2133

http://www.zjnyxb.cn

刘光宪，祝水兰，周巾英，等. 风味蛋白酶水解鸭骨工艺优化[J]. 浙江农业学报，2017，29(12)： 2128-2133.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.23

2017-09-06

江西省农业科学院青年基金(2015CQN002)；江西省科技计划(20161BBF60134)

刘光宪(1982—)，男，云南宣威人，博士，助理研究员，主要从事食品加工方面的研究。E-mail: liugx178@163.com

*通信作者，冯健雄，E-mail: fjx630320@163.com

TS251.9

A

1004-1524(2017)12-2128-06

(责任编辑高 峻)