鸭坦布苏病毒E蛋白线性化B细胞抗原表位的鉴定

张 琳，余 斌，倪 征，陈 柳，云 涛，叶伟成，华炯钢，崔言顺，张 存

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 210021； 2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

鸭坦布苏病毒E蛋白线性化B细胞抗原表位的鉴定

张 琳1，2，余 斌1，*，倪 征1，陈 柳1，云 涛1，叶伟成1，华炯钢1，崔言顺2，张 存1

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 210021； 2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

为鉴定鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)的B细胞抗原表位，以纯化的DTMUV YY5株为抗原制备了2株单克隆抗体AE4和BD10，研究证实BD10为线性化表位，其结合的抗原表位位于E蛋白的第三结构域(Domain Ⅲ，DⅢ)。将DTMUV E蛋白DⅢ结构域基因截短为具有末端相互重叠的15段，与MBP融合表达后以单克隆抗体BD10进行肽库扫描，结果筛选出DTMUV一个B细胞线性表位385LVGSGKGQI393(EP385)。该表位原核融合表达产物免疫小鼠制备的抗体，能够和DTMUV E蛋白反应，表明EP385表位具有良好的免疫原性，可为DTMUV多肽疫苗的研制及特异血清学诊断方法的开发奠定基础。

鸭坦布苏病毒；单克隆抗体；肽库扫描；抗原表位

2010年4月以来，浙江、江苏、安徽、福建、上海、山东、河北等水禽主产区先后暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋量骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病，经济损失高达数十亿元[1]。随着病原学研究的深入，该病病原被确定为一种黄病毒，即鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)[2]。近年来，鸭坦布苏病毒病的流行呈现地方流行性，是危害我国水禽养殖业的主要疫病。

DTMUV基因组由5’端和3’端非编码区和一个开放阅读框组成，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白，其中DTMUV E蛋白由501个氨基酸残基构成，含有1个糖基化位点[3-4]。根据黄病毒科病毒的结构特点，推测DTMUV E蛋白位于病毒表面，参与受体结合、膜融合和侵入等环节，在病毒感染靶细胞过程中起着关键作用[4-5]。黄病毒E蛋白在空间上形成3个不同的结构域，即DⅠ，DⅡ，DⅢ结构域[5]。DⅢ结构域是一个假定的受体结构域，是病毒与细胞受体结合的区域，其内可能含有与病毒致病性相关的抗原决定簇[6-11]。本研究针对E蛋白DⅢ结构域，融合表达15个末端相互重叠的短肽，这些短肽覆盖E蛋白DⅢ结构域的291～406位氨基酸，利用肽库扫描精确定位E蛋白DⅢ结构域的一个B细胞线性表位，为研究基于抗原表位的新型疫苗和诊断方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DTMUV YY5分离株、小鼠骨髓瘤细胞株(SP2/0)、融合表达载体pMBP-C为本实验室保存；BALB/c小鼠购自浙江省医学科学院实验动物中心。质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；胶回收试剂盒、pMD18-T载体、限制性内切酶、DNA Marker购自宝生物公司；Trans10、Trans-T1感受态购自北京全式金公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；弗氏佐剂、PEG3350、HAT、HT购自SIGMA公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 单克隆抗体制备

将DTMUV YY5株在DF-1细胞增殖后，采用不连续蔗糖梯度离心法[3]提纯病毒。纯化病毒用β-丙内酯灭活，进行BALB/c小鼠的免疫以及细胞融合[9]，用间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA[12]交叉筛选双阳性杂交瘤细胞株。

1.2.2 融合蛋白的表达及纯化

根据E蛋白基因序列，递交生物信息学网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/software.php)进行B细胞表位预测，设计一套覆盖E蛋白DⅢ结构域(AA291-AA406)并尽可能涵盖预测表位的15个短肽，这些短肽长约16个氨基酸，相邻两个短肽末端彼此重叠6～8个氨基酸。针对每条短肽合成正负2条寡核苷酸链(表1)，相互配对，每对寡核苷酸链退火后在5’端和3’端分别形成BamHI和NheI粘性末端。将退火的DNA与经BamHI、NheI双酶切的pMBP-C载体连接，转化Trans10感受态细胞，将测序正确的阳性克隆扩大培养，培养至对数生长期(D600=0.6)时加终浓度为1 mmol·L-1的IPTG，30 ℃诱导培养3 h；收集表达菌体，经超声裂解后，12 000 r·min-1离心30 min，取上清液以直链淀粉树脂柱亲和层析法纯化融合蛋白。10% SDS-PAGE检测目的蛋白表达和纯化情况。

1.2.3 抗原表位筛选

E蛋白抗原表位筛选采用间接ELISA法测定[12]。包被抗原为纯化的E蛋白DⅢ结构域及其15个短肽融合蛋白，包被浓度为5 μg·mL-1；封闭液为含5%脱脂乳的PBST(PBS，pH 7.4，含0.1% Tween-20)，37 ℃封闭2 h。一抗为单抗杂交瘤细胞培养上清液，37 ℃孵育1 h；二抗为1∶5 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37 ℃孵育1 h。显色液为TMB，避光显色10 min后加入H2SO4终止液终止反应，450 nm波长测量吸收值。

1.2.4 抗原表位鉴定

以免疫印迹试验(Western blot)鉴定E蛋白抗原表位。将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂乳封闭，4 ℃冰箱中过夜；用PBST洗3次，置于1∶10稀释的杂交瘤细胞培养上清中，室温孵育1 h；洗涤3次后置于1∶5 000稀释的酶标羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，洗涤3次后，以DAB显色。

1.2.5 抗原表位的抗原性验证

在E蛋白DⅢ结构域的15段短肽中，单克隆抗体BD10与E12和E13的2个相邻重组蛋白呈现明显的阳性反应，而其他短肽则呈阴性。为此，针对E12，E13重叠部分(385LVGSGKGQI393)，按大肠杆菌密码子优化合成2条寡核苷酸链(F∶5’-gatccAtcttagtaggaagtggaaaaggacagg-3’，R∶5’-ctagcctgtccttttccacttcctactaagaTg-3’)，进行表位多肽的表达和纯化。以重组蛋白免疫试验兔制备高免血清，Western Blot检验其与E蛋白及其表位的免疫反应。

表1编码短肽寡核苷酸序列表

Table1Synthesized DNA sequences which encoding the short peptides

引物Primer引物序列(5’～3’)PrimersequenceE1F：gatccATGCAGGGTTTGAAGCTGAAAGGAATGACCTACCCGATGTGTAGCAATgR：ctagcATTGCTACACATCGGGTAGGTCATTCCTTTCAGCTTCAAACCCTGCATgE2F：gatccATGACCTACCCGATGTGTAGCAATACATTTTCCCTAGTGAAGAATCCTgR：ctagcAGGATTCTTCACTAGGGAAAATGTATTGCTACACATCGGGTAGGTCATgE3F：gatccACATTTTCCCTAGTGAAGAATCCTACCGACACTGGGCATGGCACTGTCgR：ctagcGACAGTGCCATGCCCAGTGTCGGTAGGATTCTTCACTAGGGAAAATGTgE4F：gatccACCGACACTGGGCATGGCACTGTCGTGGTGGAATTGTCTTATGCAgR：ctagcTGCATAAGACAATTCCACCACGACAGTGCCATGCCCAGTGTCGGTgE5F：gatccGTGGAATTGTCTTATGCAGGTACCGATGGGCCCTGTAGAGTTCCCATATCCgR：ctagcGGATATGGGAACTCTACAGGGCCCATCGGTACCTGCATAAGACAATTCCACgE6F：gatccGATGGGCCCTGTAGAGTTCCCATATCCATGTCGGCAGATCTGAATgR：ctagcATTCAGATCTGCCGACATGGATATGGGAACTCTACAGGGCCCATCgE7F：gatccATGTCGGCAGATCTGAATGACATGACACCAGTTGGACGCTTGATAgR：ctagcTATCAAGCGTCCAACTGGTGTCATGTCATTCAGATCTGCCGACATgE8F：gatccATGACACCAGTTGGACGCTTGATAACAGTCAACCCATACGTGTCGgR：ctagcCGACACGTATGGGTTGACTGTTATCAAGCGTCCAACTGGTGTCATgE9F：gatccATAACAGTCAACCCATACGTGTCGACCTCCTCCACGGGTGCCAAGATAgR：ctagcTATCTTGGCACCCGTGGAGGAGGTCGACACGTATGGGTTGACTGTTATgE10F：gatccTACGTGTCGACCTCCTCCACGGGTGCCAAGATAATGGTGGAAGTGgR：ctagcCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCGTGGAGGAGGTCGACACGTAgE11F：gatccGCCAAGATAATGGTGGAAGTGGAACCTCCATTCGGGGATTCAgR：ctagcTGAATCCCCGAATGGAGGTTCCACTTCCACCATTATCTTGGCgE12F：gatccCCTCCATTCGGGGATTCATTCATCTTAGTAGGAAGTGGAAAAGGAgR：ctagcTCCTTTTCCACTTCCTACTAAGATGAATGAATCCCCGAATGGAGGgE13F：gatccTTAGTAGGAAGTGGAAAAGGACAGATCAGGTACCAGTGGCATAGAgR：ctagcTCTATGCCACTGGTACCTGATCTGTCCTTTTCCACTTCCTACTAAgE14F：gatccCAGATCAGGTACCAGTGGCATAGAAGTGGGAGCACAATTGGAAAAgR：ctagcTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATGCCACTGGTACCTGATCTGgE15F：gatccCATAGAAGTGGGAGCACAATTGGAAAAgR：ctagcTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATGg

2 结果

2.1 单克隆抗体制备

以纯化的DTMUV为抗原，按常规方法进行小鼠免疫和细胞融合，用间接免疫荧光(IFA)和DⅢ-ELISA交叉筛选到2株双阳性单克隆抗体，分别命名为AE4和BD10(图1)。免疫印迹结果显示，BD10能够特异性地识别DTMUV E蛋白，而AE4则不能(图2)。由此推定BD10识别病毒E蛋白DⅢ结构域的线性表位，而AE4可能识别的是构象表位。

A，AE4；B，BD10；C，阳性对照；D，阴性对照A， AE4； B， BD10； C， positive control； D， negative control图1 单克隆抗体的间接免疫荧光反应Fig.1 IFA results of McAbs against DTMUV

2.2 融合蛋白的表达与纯化

将编码DTMUV E蛋白的15个短肽和表位短肽的核苷酸序列，插入大肠杆菌表达载体pMBP-C，重组菌经IPTG诱导后，SDS-PAGE显示在细胞裂解上清中可见到与目的蛋白大小一致的条带。将上述可溶性表达产物过Amylose亲和层析柱纯化后，获得了纯化的融合蛋白(图3)。

2.3 抗原表位的筛选

15段短肽链经可溶性表达、纯化后，用ELISA 和Western blot法进行肽库扫描。结果显示短肽E12和E13能够与BD10呈阳性反应(图4，图5)。E12和E13两个融合短肽中，重叠的序列为LVGSGKGQ(图6)。为进一步验证该氨基

酸序列，重新设计并合成了表达该短肽的核苷酸序列，经原核表达和Western blot鉴定，结果显示385LVGSGKGQ393为单抗BD10所识别线性表位的核心序列，将该表位命名为EP385。

2.4 抗原表位的抗原性验证

A，BD10；B，AE4。M，marker; 1，MBP；2，MBP-E 重组蛋白A， BD10；B， AE4. M， marker; 1， MBP；2， MBP-E recombinant protein 图2 单克隆抗体的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of MAb BD10 and AE4

融合表达的表位短肽纯化后免疫小鼠，制备免疫血清，通过免疫印迹反应分析，结果表明融合的表位短肽能够诱导小鼠产生针对表位的特异性抗体，验证385LVGSGKGQ393确实是B细胞的1个线性表位，且具有良好的免疫原性和反应原性(图7)。

M，marker；1，MBP空载体；E1～E15，MBP-短肽融合蛋白；94102，MBP-EP385M， marker； 1， MBP； E1-E15， MBP-Peptide fusion protein； 94102， MBP-EP385图3 短肽和表位融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion proteins

图4 表位的ELISA筛选Fig.4 Mapping of epitopes by ELISA with BD10

3 讨论

研究抗原表位有助于了解抗原结构及抗原变异预测，为表位疫苗以及分子诊断技术研究奠定基础。常用的鉴别B细胞抗原表位的方法主要有：肽探针扫描技术、噬菌体展示技术和计算机软件预测等[14]。软件预测虽然简单快速，但准确性欠佳，预测结果只能作为确定各个蛋白潜在表位的参考，最终还需进一步的实验结果来确认[15]。本文以制备的单克隆抗体为研究工具，采用间接ELISA及Western blot法进行肽库扫描，结合计算机模拟分析对抗原表位进行研究，取得了较为理想的结果。

图5 表位的western blot 筛选Fig.5 Mapping of epitopes by western blot with BD10

图6 E蛋白表位鉴定结果示意图Fig.6 Schematic diagram of E protein epitope identification

M， marker；1，DⅢ重组蛋白；2，MBP-EP385；3，MBP-E融合蛋白M， marker； 1， DⅢ recombinant protein； 2， MBP-EP385； 3， MBP-E recombinant protein图7 Western blot鉴定抗原表位EP385Fig.7 Western blot confirmation of the epitope EP385

在单克隆抗体制备过程中，采用间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA交叉筛选，获得AE4和BD10 2株双阳性单克隆抗体。Western blot鉴定结果显示，BD10能够特异性的识别DTMUV E蛋白，而AE4则不能，由于SDS-PAGE凝胶电泳和转印过程中蛋白变性，由此推测单抗BD10识别DTMUV E蛋白的线性表位，而单抗AE4识别E蛋白的构象表位。为了更详细地研究BD10的特异性以及对其表位进行作图，将DTMUV YY5株E蛋白DⅢ区截短为具有部分序列重叠的15段短肽，以大肠杆菌表达系统原核表达为融合MBP标签的重组蛋白，用肽探针扫描技术鉴定BD10识别的核心区域为385LVGSGKGQI393，序列对比表明该表位序列与GenBank已公布鸭、鹅坦布苏E蛋白相应序列均保守。

鸭坦布苏病毒病作为一种新发传染病，近年来已经传播至全国各水禽主产区，严重影响鸭鹅产业的健康发展[16-18]。本研究鉴定出坦布苏病毒E蛋白B细胞线性表位，对于研究鸭坦布苏病毒的表位疫苗和建立诊断方法具有重要意义。

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IdentificationoflinearBcellepitopeforEproteinofduckTembusuvirus

ZHANG Lin1，2，YU Bin1，*， NI Zheng1，CHEN Liu1，YUN Tao1，YE Weicheng1，HUA Jionggang1，CUI Yanshun2，ZHANG Cun1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinarySciences，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China；2CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

This experiment was conducted to identify B cell epitope of E protein of duck Tembusu virus (DTMUV). In this study， a linear B cell epitope385LVGSGKGQI393(EP385) for DTMUV E protein were identified by truncated expressing the third domain of E protein (Domain III， DIII)， which is recognized by monoclonal antibody BD10 prepared by the purified DTMUV YY5 strain as antigen， and then by scanning the peptide library which containing 15 overlapping segment of truncated and fused expressed DIIIwith BD10. Then， the immunogenicity of EP385 was verified by fusion expressed inE.coliand immunized mice to prepare a polyclonal antibody which was confirmed to be capable of recognizing viral E protein. The identification of B cell epitope for the E protein of DTMUV may lead to the preparation of a DTMUV peptide vaccine and the development of specific serological diagnostic methods.

duck Tembusu virus; monoclonal antibody; peptide library scanning; epitope

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2009-2014

http://www.zjnyxb.cn

张琳，余斌，倪征，等. 鸭坦布苏病毒E蛋白线性化B细胞抗原表位的鉴定[J].浙江农业学报，2017，29(12)： 2009-2014.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.08

2016-08-22

国家重点研发计划(2016YFD0500100)；浙江省自然科学基金(LY15C18002)；浙江省公益技术研究农业项目(2016C32070)

张琳(1986—)，女，黑龙江大兴安岭人，硕士研究生，主要从事动物检疫与食品检验研究。E-mail: zhanglin_0109@126.com

*通信作者，余斌，E-mail: biogiant@126.com

S858.32

A

1004-1524(2017)12-2009-06

(责任编辑万 晶)