25-羟基维生素D3对肉鸡生长性能、骨骼矿化及肠道维生素D受体基因表达的影响

张金龙 ， 张 宁 ， 杨 雪 ， 陈冠华 ， 王志祥 ， 瞿红侠 ， 韩进诚 *， 陈建成

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.商丘师范学院生命科学学院，河南商丘476000；3.河南正本清源科技发展股份有限公司，河南商丘 476000）

25-羟基维生素D3对肉鸡生长性能、骨骼矿化及肠道维生素D受体基因表达的影响

张金龙1，2， 张 宁1，2， 杨 雪1，2， 陈冠华1，2， 王志祥1， 瞿红侠2， 韩进诚2*， 陈建成3

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.商丘师范学院生命科学学院，河南商丘476000；3.河南正本清源科技发展股份有限公司，河南商丘 476000）

为研究25-羟基维生素D3（25-OH-D3）对1～28日龄白羽肉鸡生长性能、骨骼矿化以及肾脏1α-羟化酶、肠道细胞核维生素D受体（nVDR）和细胞膜维生素D受体（mVDR）基因表达的影响，试验选用1日龄罗斯308白羽肉鸡公雏240只，随机分成4个处理，每个处理6个重复，每个重复10只鸡。Ⅰ组为基础日粮组（不添加维生素D），Ⅱ组为正对照组（基础日粮中添加1000 IU/kg的维生素D3），Ⅲ、Ⅳ组为试验组（分别饲喂在基础日粮中添加500、1000 IU/kg的25-OH-D3）。结果显示：（1）与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组1～28日龄肉鸡体增重、采食量提高，料重比降低（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组1～28日龄肉鸡体增重、采食量、料重比差异不显著（P＞0.05）。（2）与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组28日龄肉鸡胫骨、股骨和跖骨重量、灰分重量及钙、磷含量得到显著改善（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ组胫骨、股骨和跖骨灰分重量提高（P＜0.05）；Ⅳ组与正对照Ⅱ组28日龄肉鸡骨骼矿化无显著差异（P＞0.05）。（3）与基础日粮Ⅰ组及正对照Ⅱ组相比，Ⅲ组28日龄肉鸡肾脏1α-羟化酶mRNA表达水平提高234.72%和243.73%（P＜0.01）；与试验Ⅲ组相比，试验Ⅳ组肾脏1α-羟化酶mRNA表达水平降低10.46%（P＜0.05）。（4）与基础日粮Ⅰ组及正对照Ⅱ组相比，Ⅲ组28日龄肉鸡十二指肠nVDR mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）；与试验Ⅲ组相比，试验Ⅳ组十二指肠nVDR mRNA表达水平降低32.56%（P＜0.05）。（5）与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ组28日龄肉鸡十二指肠mVDR mRNA表达水平提高25.29%（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，试验Ⅲ组mVDR mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）；与试验Ⅲ组相比，试验Ⅳ组mVDR mRNA表达水平降低24.50%（P＜0.05）。试验表明：日粮中添加500 IU/kg的25-OH-D3可显著提高肉鸡肾脏1α-羟化酶和十二指肠mVDR mRNA表达水平，改善肉鸡生长性能和骨骼矿化。

25-羟基维生素D3；生长性能；骨骼矿化；维生素D受体；肉鸡

This experiment was to evaluate the effects of dietary 25-hydroxycholecalciferol （25-OH-D3）levels on growth performance and bone mineralization，as well as the mRNA expression levels of 1α-hydroxylase in the kidney，nuclear vitamin D receptor （nVDR），and membrane vitamin D receptor （mVDR）in the duodenum of broiler chickens from 1 to 28 days of age.A total of 240 one-day-old male birds were randomly assigned to 4 groups with 6 replicates per group and 10 birds per replicate.Diet 1 was the basal diet without vitamin D.Diet 2 was the control diet with 1000 IU/kg vitamin D3.Diet 3 and 4 were the basal diet supplemented with 500 IU/kg and 1000 IU/kg 25-OH-D3.The results showed as follows：（1） The broilers fed 500 IU/kg and 1000 IU/kg 25-OH-D3had greater body weight gain （BWG），feed intake （FI）and lower feed conversion ratio （FCR） compared with the birds fed the basal diet（P ＜ 0.05）.No significant differences in growth performance were observed in broilers fed diets with 25-OH-D3and birds fed the control diet （P ＞ 0.05）.（2）The weight，ash weight，and the content of calcium and phosphorus in tibia，femur，and metatarsus of broilers fed 500 IU/kg and 1000 IU/kg 25-OH-D3were higher than those of birds fed the basal diet （P ＜ 0.05）.The leg bone ash weight of broilers fed 500 IU/kg 25-OH-D3was greater than that of birds fed the control diet（P ＜ 0.05）.By contrast，no significant differences in leg bone mineralization were observed between the birds fed 1000 IU/kg 25-OH-D3and the birdsfed the control diet（P ＞ 0.05）.（3）The mRNA expression level of 1α-hydroxylase in the kidney of birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3increased by 234.72%and 243.73%compared with the birds fed the basal diet and control diet（P ＜ 0.01）.By contrast，the mRNA expression level of 1α-hydroxylase in the kidney of birds fed the diet with 1000 IU/kg 25-OH-D3decreased by 10.46%compared with the birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3（P ＜ 0.05）.（4）No significant difference in the mRNA expression level of nVDR in the duodenum were observed among the birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3，the basal diet and the control diet （P ＞ 0.05）.（5）The mRNA expression level of nVDR in the duodenum of birds fed the diet with 1000 IU/kg 25-OH-D3decreased by 32.56%compared with the birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3（P＜0.05).The mRNA expression level of mVDR in the duodenum of birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3increased by 25.29%compared with the birds fed the basal diet（P ＜ 0.05）.No significant difference in the mVDR mRNA expression level was observed between the birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3and the birds fed the control diet （P ＞ 0.05）.The mVDR mRNA expression level in the duodenum of birds fed the diet with 1000 IU/kg 25-OH-D3decreased by 24.50%compared with the birds fed the diet with 500 IU/kg 25-OH-D3（P ＜ 0.05）.These data indicated that 500 IU/kg 25-OH-D3could up-regulate the mRNA expression of 1α-hydroxylase in the kidney and nVDR in the small intestine and improve the growth performance and bone mineralization of broiler chickens.

25-hydroxycholecalciferol；growth performance；bone mineralization；vitamin D receptor；broiler chicken

维生素D可调节动物肠道钙、磷的吸收，但在现代集约化饲养条件下，家禽缺乏紫外线照射，因此饲料业中通常添加外源性维生素D3（VD3）或其衍生物来调节家禽体内钙、磷的代谢，以维持肉鸡正常生长 （Mitchell等，1997；Edwards 等，1994）。瞿红侠等（2015）研究表明，以生长性能和骨骼矿化指标来评价25-OH-D3的生物学效价约为VD3的1.81倍。日粮中用25-OH-D3代替VD3可增加肉鸡体增重（Fritts等，2003）、改善骨骼的矿化（Janocha等，2009）、促进肠道发育和提高免疫力（Gabriela 等，2013；Chou 等，2009）。

维生素D3经过肝脏25-羟化酶、肾脏1α-羟化酶转化为最终活性产物 1,25-（OH)2-D3，1,25-（OH)2-D3可通过血液进入肠道上皮细胞，与两种受体结合后调节肠道磷吸收，两种受体分别为肠道上皮细胞核受体 （nVDR）和细胞膜受体（mVDR），1,25-（OH)2-D3分别与nVDR、mVDR结合后，促进小肠黏膜对钙、磷的吸收，增加血液中钙、磷离子浓度，维持机体钙、磷平衡（赵成毅等，2012；Tunsophon 等，2010；Nemere等，2004）。

研究发现，基础日粮中25-OH-D3适宜添加量为 500 IU/kg左右 （陈冠华等，2017；Han等，2016；瞿红侠等，2015）。本试验旨在研究基础日粮中添加500 IU/kg和1000 IU/kg的 25-OH-D3对1～28日龄肉鸡生长性能、骨骼矿化以及肾脏1α-羟化酶、nVDR、mVDR 基因表达的影响，为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选取1日龄健康、体重均匀的罗斯308肉鸡公雏240只，随机分为4组，每组6个重复，每重复10只。试验期为1～28日龄。肉鸡进行笼养（200 cm×50 cm×35 cm）。 饲喂粉状配合饲料，自由采食，充足饮水，按常规免疫程序进行免疫接种。

1.2 试验日粮与试验设计 本试验采用的基础日粮营养水平参考NRC（1994）和《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）中肉鸡营养需要推荐值。Ⅰ组饲喂基础日粮（不添加维生素D），Ⅱ组为正对照（基础日粮中添加1000 IU/kg的VD3），Ⅲ、Ⅳ组为试验组（分别饲喂在基础日粮中添加500、1000 IU/kg的25-OH-D3）。基础日粮组成及营养水平见表1。VD3添加剂购自桐乡市天和诚食品科技有限公司，25-OH-D3添加剂购自山东海能生物工程有限公司。

1.3 样品收集与分析

1.3.1 生长性能测定 在28日龄时空腹称重，试验期间每天记录各重复肉鸡采食量、死亡鸡数，死亡鸡只称重扣除采食量。统计试验期采食量，计算采食量、体增重和料重比（采食量/体增重）。

1.3.2 血浆指标测定 28日龄时，每重复选取1只与重复平均体重相近的肉鸡进行屠宰试验。用1 mg/mL肝素钠溶液润湿注射器，心脏采血5 mL，3000 r/min离心10 min，血浆冷冻保存（-20℃）。用岛津CL-8000全自动生化分析仪测定血浆钙浓度和血浆无机磷浓度。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.3.3 骨骼指标测定 在28日龄时进行屠宰试验，每重复取1只，剥离胫骨、股骨和跖骨。将骨骼放入样品袋密封，冷冻保存（-20℃）。将左侧骨骼（胫骨、股骨和跖骨）在沸水中煮3～5 min，去除残余肌肉、腓骨，剥离干净后，烘箱中105℃烘干24 h，用分析天平称量骨骼重量。用游标卡尺测定腿部左侧骨骼长度和直径（骨骼长度1/2处）。将骨骼压碎，放入坩埚，在茂福炉中600℃灰化36 h，测定灰分重量。骨骼样品分别采用EDTA滴定法测定钙（Ca）含量，钼黄比色法测定磷（P）含量。

1.3.4 肠道和肾脏总RNA的提取、反转录和PCR扩增 28日龄时屠宰，每重复取1只，分别收集肉鸡十二指肠前1/2处黏膜样品和右侧肾脏组织样品，-80℃保存。

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，根据GenBank公布的鸡肾脏1α-羟化酶、肠道nVDR、肠道mVDR和GAPDH mRNA序列，使用Primer 5.0软件设计引物，引物序列及参数详见表2。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

取80 mg左右样品，按照宝生物工程（大连）有限公司的Takara RNAiso Plus（Code No.9108）说明书提取总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，使用超微量核酸蛋白测定仪检测OD值及RNA浓度。

表2 PCR引物序列及参数

按照Takara逆转录试剂盒 （Code No.RR047A）说明书进行基因组去除反应（42℃、5 min）和反转录反应（37 ℃、15 min，85 ℃、5 s），将RNA逆转录成cDNA，-20℃保存。

使用 Takara荧光定量试剂盒 （Code No.RR820A）进行实时荧光定量PCR（qPCR），qPCR反应体系为10μL，反应程序：95℃预变性1 min，95℃变性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，40个循环。记录Ct值，试验结果采用2-△△Ct法对数据进行统计分析（Livak等，2001）。

1.4 统计分析 以每重复为试验单元，用SAS 9.2数据统计软件对试验数据进行GLM分析，Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 25-OH-D3对1～28日龄肉鸡生长性能的影响 由表3可知，与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组肉鸡体增重分别提高 81.25%、72.83%（P＜0.05）；采食量提高 39.57%、33.57%（P ＜ 0.05）；料重比降低23.04%、22.54%（P＜0.05）。与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组1～28日龄肉鸡体增重、采食量、料重比差异不显著（P＞0.05）。Ⅲ组肉鸡的血浆钙、磷含量显著高于正对照Ⅱ组（P＜0.05），但与试验Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。

表3 25-OH-D3对1～28日龄肉鸡生长性能的影响

2.2 25-OH-D3对28日龄肉鸡骨骼参数的影响

2.2.1 25-OH-D3对28日龄肉鸡胫骨矿化的影响 由表4可知，与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组肉鸡的胫骨骨重、长度、直径、灰分重量、灰分含量及钙、磷含量显著提高（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组除直径及灰分重量外骨骼参数差异不显著（P ＞ 0.05）。

表4 25-OH-D3对28日龄肉鸡胫骨矿化的影响

2.2.2 25-OH-D3对28日龄肉鸡股骨矿化的影响 由表5可知，与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组股骨骨重、长度、灰分重量、灰分含量及钙、磷含量显著提高（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ组股骨重量、直径及灰分重量显著提升（P＜0.05）。

表5 25-OH-D3对28日龄肉鸡股骨矿化的影响

2.2.3 25-OH-D3对28日龄肉鸡跖骨矿化的影响 由表6可知，与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组跖骨骨重、长度、灰分重量、灰分含量及钙、磷含量显著提高（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ组跖骨灰分重量显著提升（P＜0.05）。

表6 25-OH-D3对28日龄肉鸡跖骨矿化的影响

2.3 25-OH-D3对28日龄肉鸡肾脏及肠道相关基因表达的影响

2.3.1 25-OH-D3对28日龄肉鸡肾脏1α-羟化酶mRNA表达的影响 由图1可知，与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ组1α-羟化酶mRNA表达水平分别提高234.73%和199.73%（P＜0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组1α-羟化酶mRNA表达水平分别显著提高了 243.72%和207.79%（P＜0.05）。与试验Ⅲ组相比，试验Ⅳ组1α-羟化酶mRNA表达水平显著降低了10.46%（P＜0.05）。

图1 25-OH-D3对28日龄肉鸡肾脏1α-羟化酶 mRNA表达的影响

2.3.2 25-OH-D3对28日龄肉鸡十二指肠nVDR mRNA表达的影响 由图2可知，与基础日粮Ⅰ组及正对照II组相比，Ⅲ、Ⅳ组十二指肠nVDR mRNA表达水平未受显著影响（P＞0.05）；但与Ⅲ组相比，试验Ⅳ组十二指肠中nVDR mRNA表达水平下降32.56%（P＜0.05）。

图2 25-OH-D3对28日龄肉鸡十二指肠nVDR mRNA表达的影响

2.3.3 25-OH-D3对28日龄肉鸡十二指肠mVDR mRNA表达的影响 由图3可知，与基础日粮Ⅰ组相比，Ⅲ组十二指肠mVDR mRNA表达量提高25.29%（P ＜ 0.05）；与正对照Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组十二指肠mVDR mRNA表达量未受显著影响 （P＞0.05）；而与Ⅲ组相比，试验Ⅳ组十二指肠中mVDR mRNA表达量降低24.50%（P＜0.05）。

图3 25-OH-D3对28日龄肉鸡十二指肠mVDR mRNA表达的影响

3 讨论

3.1 25-OH-D3对1～28日龄肉鸡生长性能的影响 Han等（2016）研究表明，当基础日粮中添加400 IU/kg 25-OH-D3时可显著提高1～21日龄肉鸡体增重和采食量，降低料重比和死亡率。Goodgame 等（2011）发现，日粮中 25-OH-D3水平由100 IU/kg增加到800 IU/kg时，7～21日龄肉鸡体重和采食量显著提高；当25-OH-D3水平上升至3200 IU/kg时，肉鸡生长性能未受显著影响。进一步研究发现，肉鸡日粮中25-OH-D3适宜添加水平约为500 IU/kg（陈冠华等，2017）。本试验结果表明，基础日粮中添加500 IU/kg 25-OHD3能显著增加28日龄肉鸡体增重和采食量，降低料重比；但1000 IU/kg 25-OH-D3对生长性能无显著影响。

3.2 25-OH-D3对28日龄肉鸡骨骼矿化的影响骨骼矿化是评定家禽维生素D作用效果的敏感指标。研究表明，在肉鸡基础日粮中添加适量VD3、25-OH-D3或 1α-羟基维生素 D3均能显著提高肉鸡骨骼的重量、长度、灰分重、灰分百分含量及钙、磷含量（陈冠华等，2017；王建国等，2015；Han 等，2013）。 Han 等（2016）研究显示，日粮中25-OH-D3水平由50 IU/kg提高到400 IU/kg时，21日龄肉鸡股骨和胫骨重量、长度、灰分重量、灰分含量、钙含量和磷含量显著提高。Goodgame等（2011）报道，25-OH-D3水平由 100 IU/kg 增加到800 IU/kg时能显著提高21日龄肉鸡胫骨和趾骨灰分含量，但进一步提高25-OH-D3水平对骨骼矿化无显著影响。另外，研究发现，日粮中25-OH-D3水平由400 IU/kg提高到3000 IU/kg时，未能显著影响北京鸭胫骨的重量、长度、灰分含量、磷含量、钙含量等指标（石文标等，2013）。陈冠华等（2017）报道，肉鸡日粮中添加500 IU/kg的25-OH-D3可以维持骨骼矿化。本试验取得类似的结果，与基础日粮组相比，500 IU/kg的25-OHD3可显著改善肉鸡腿骨矿化，并达到正对照组水平；但继续提升25-OH-D3水平到1000 IU/kg时，肉鸡骨骼矿化没有得到进一步改善。

3.3 25-OH-D3对28日龄肉鸡肾脏及肠道相关基因表达的影响 维生素D在动物体内可转化为 1，25-（OH）2-D3，从而促进钙、磷的吸收和骨骼矿化。25-OH-D3可直接在肾脏1α-羟化酶的羟基化作用下快速转化为1,25-（OH）2-D3。本试验通过在日粮中添加25-OH-D3上调了1α-羟化酶mRNA的表达量，表明1α-羟化酶在 25-OH-D3转化为 1,25-（OH）2-D3的过程中起着重要作用。

在动物肠道上皮细胞中，维生素D需要与两种维生素D受体结合后发挥作用。这两种受体分别为细胞核维生素D受体（nVDR）和细胞膜维生素D受体 （mVDR）。据报道，nVDR在动物肝脏、肾脏、骨骼、肠道等多种组织中表达，维生素D对多数组织中nVDR基因表达具有调节作用。王宝维等（2014）研究表明，日粮中VD3的水平提高到800 IU/kg时，鹅肝脏nVDR mRNA表达量显著线性提升；但VD3添加水平上升到3200 IU/kg时，nVDR mRNA表达量显著降低。顾海燕等（2009）研究表明，1,25-（OH)2-D3可提升成骨细胞nVDR mRNA表达量。龙艳丽（2014）研究显示，腹腔注射VD3可显著影响乌骨鸡小肠nVDR表达。但张巍等（2009）研究表明，添加维生素D对大鼠肾脏nVDR mRNA表达无显著影响。研究表明，日粮中添加25-OH-D3衍生物1α-OH-D3可显著提升肉鸡肠道nVDR mRNA表达量（王建国，2016）。本试验结果显示，添加500 IU/kg 25-OH-D3可提升肠道nVDR mRNA表达量，但差异不显著；25-OH-D3水平提高到 1000 IU/kg时，十二指肠nVDR mRNA相对表达量显著下降。表明25-OH-D3对nVDR基因表达的调节作用受到剂量的影响。

在动物体内，mVDR在1,25-（OH)2-D3调节肠道无机磷吸收过程中也起到重要作用（梁芬芬等，2012；Nemere 等，2004）。 但鲜见 25-OH-D3调节细胞膜维生素D受体mVDR基因表达的报道。本试验发现，与基础日粮组相比，添加500 IU/kg 25-OH-D3组肉鸡十二指肠中mVDR mRNA表达量显著提高25.29%。但日粮中25-OH-D3水平提高到1000 IU/kg时，肉鸡十二指肠中mVDR mRNA表达量受到显著抑制。

4 结论

4.1 日粮中添加500 IU/kg的25-OH-D3可显著改善肉鸡生长性能，增强胫骨、股骨和跖骨矿化。

4.2 日粮中添加500 IU/kg的25-OH-D3可显著提升肉鸡肾脏1α-羟化酶和十二指肠mVDR mRNA表达水平，趋于提高十二指肠中nVDR mRNA表达量。

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S816.7

A

1004-3314（2017）24-0024-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172406

国家自然科学基金项目（31101732）；河南省教育厅项目（16A230003）

*通讯作者