真空包装免泡豆杆优势腐败细菌分离鉴定及其致腐能力分析

郑丽君，申光辉*，张志清，李辰凤，陈安均，黎杉珊，吴贺君，罗松明

真空包装免泡豆杆优势腐败细菌分离鉴定及其致腐能力分析

郑丽君，申光辉*，张志清，李辰凤，陈安均，黎杉珊，吴贺君，罗松明

（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

以真空包装免泡豆杆为研究对象，分离鉴定其中的腐败细菌，并分析耐高温优势腐败菌的腐败能力，为产品质量控制提供参考。采用选择性培养基对免泡豆杆中腐败细菌进行分离纯化，并测定菌株的耐高温及产蛋白酶能力，通过形态、生理生化特征结合16S rRNA、gyrB基因序列分析对优势腐败细菌进行分类鉴定。将优势腐败菌接种到无菌免泡豆杆中，通过样品感官评价、质构特性、挥发性盐基氮值（TVB-N）、蛋白酶活力及pH值的分析，比较不同腐败菌株对免泡豆杆的腐败能力。从腐败样品中共分离获得20 株不同的腐败菌，其中有12 株可耐受110 ℃、20 min高温处理，且具有较强的产蛋白酶能力。回接验证实验结果表明，接种4 株优势耐高温腐败菌的免泡豆杆样品，37 ℃贮藏至第7天发生明显腐败变质，样品TVB-N、蛋白酶活力及pH值显著高于未接菌对照样品；此外，硬度、弹性、胶着性、耐咀性等产品质构特性也显著低于对照样品。4 株优势腐败菌均为芽孢杆菌，通过比较TVB-N产量因子确定腐败能力最强的是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）DY1a，其次依次分别为解淀粉芽孢杆菌DY1b，枯草芽孢杆菌（B. subtilis）DY3和DY2a。

免泡豆杆；芽孢杆菌；gyrB基因；腐败能力；质构特性

豆杆是我国四川隆昌、重庆梁平等地的一种传统非发酵豆制品，也称豆筋，豆棒。其中隆昌豆杆历史悠久、品质优良，产品质地细腻，绵软筋道，豆香浓郁，深受消费者喜爱，已被列为国家地理标志保护产品。传统豆杆是将大豆经清洗浸泡、磨浆、过滤煮浆、起皮、裹棒成型，烘至半干，再次裹棒成型，最后干制而成的棒状豆制品[1]。豆杆食用前需在常温下复水4～6 h，耗时费力，极不方便，且不同水质对复水后的产品品质影响较大。近年来，企业为满足消费者食用方便的需求，将传统豆杆复水，真空包装成免泡豆杆，开袋即烹即食，节约时间，更加方便消费者食用，消费市场潜力巨大。免泡豆杆中大豆蛋白、脂肪、糖类等营养成分丰富，且水分含量高，非常适宜腐败微生物生长繁殖，因此免泡豆杆货架期内极易发生腐败胀袋，严重影响产品品质与食用安全。

目前国内外研究发现，由于大豆原料来源不同及加工生产环境状况差异，传统非发酵豆制品腐败微生物种类及其多样性差异较大。部分研究发现，芽孢杆菌是主要的腐败微生物。如变质豆浆主要腐败菌为地衣芽孢杆菌，短小芽孢杆菌和短芽孢杆菌[2]；豆腐干中主要腐败菌为枯草芽孢杆菌[3]。另外研究结果发现，除芽孢杆菌外还有其他类群腐败微生物。如内酯豆腐中的主要腐败菌有坚强芽孢杆菌和屎肠球菌[4-5]，卤水豆腐的主要腐败菌为短小芽孢杆菌和恶臭假单胞菌[6]。研究还发现豆腐中存在发酵乳杆菌、梨形肠杆菌、肠膜明串珠菌等乳酸菌[7-8]。豆腐丝主要腐败细菌有成团肠杆菌、短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌[9]；发现白干和薄百叶中主要腐败菌除枯草芽孢杆菌外，还有溶酪葡萄球菌、约翰逊不动杆菌和戊糖片球菌[10]。豆腐干中腐败菌除枯草芽孢杆菌，还有恶臭假单胞菌[11]。

本实验主要对真空包装免泡豆杆中优势腐败细菌进行分离鉴定，并比较分析耐高温腐败细菌对免泡豆杆的腐败能力，确定优势腐败菌及其对豆杆质构特性品质的影响，为免泡豆杆的杀菌防腐工艺条件研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆杆由四川山古坊食品有限公司提供。

主要培养基[12]：LB液体培养基、PCA琼脂培养基、VRBA琼脂培养基、酪蛋白培养基、STAA琼脂培养基、假单胞菌CFC选择性培养基、MSA培养基、气单胞菌培养基（AMB）、锰盐营养琼脂 青岛海博生物技术有限公司。

主要试剂：TIANamp Bateria DNA Kit（DP302）天根生化科技（北京）有限公司；MasterMix Taq、Loading buffer、核酸染料 成都康迪生物技术有限公司；微生物生理生化鉴定管 杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CPA225D型电子天平 德国赛多利斯股份公司；FW-400A倾斜式高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；ECLIPSE E100型生物显微镜 日本Nikon公司；YXQ-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；MyCyclerTM Thermal Cycler PCR仪、Gel Doc XR＋凝胶成像分析仪 美国Bio-Rad公司；TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro公司。

1.3 方法

1.3.1 免泡豆杆腐败细菌的分离纯化

取腐败免泡豆杆样品（25±1）g，无菌条件下充分研磨后转入加有225 mL 0.85%无菌生理盐水的锥形瓶，200 r/min振荡30 min，静置5 min，用0.85%生理盐水10倍梯度稀释，选择3 个稀释梯度，各取1 mL梯度稀释液，采用倾注法，利用不同选择性培养基分离并统计各种培养基分离典型菌株的分离频率。选择3 批次样品，每个批次随机选取3 袋样品进行分离。根据菌落的形状、大小和颜色等形态特征，挑取不同选择性培养基上单菌落进行纯化，镜检，斜面保藏。菌落总数用PCA琼脂培养基分离计数；葡萄球菌和微球菌（Micrococcaceae）用MSA琼脂培养基分离计数；芽孢杆菌（Bacillus）用锰盐营养琼脂培养基分离计数；肠杆菌（Enterobacteriaceae）用VRBA琼脂培养基分离计数；乳酸菌数用MRS琼脂培养基进行统计；热杀索丝菌用STAA琼脂培养基分离计数；绿脓假单胞菌用CFC培养基分离计数；气单胞菌用AMB培养基分离计数。其中热杀索丝菌30 ℃培养，其他细菌37 ℃培养，培养时间均为48 h。

1.3.2 腐败细菌耐高温及其产蛋白酶能力测定

从分离纯化菌株中筛选既能够耐受110 ℃高温处理，同时具有较强的产蛋白酶能力腐败菌。

1.3.2.1 耐高温能力测定

将分离菌株接种于无菌LB液体培养基中37 ℃培养12 h，调节菌悬液浓度为107～108CFU/mL，经110 ℃灭菌20 min处理后，取1 mL菌悬液，采用倾注法于37 ℃培养24 h计数，并采用微生物残活率进行评价[14]，按公式（1）计算。

式中：lgS为高温处理前后菌落总数降低的对数值；N0为高温处理前菌悬液中的微生物浓度/（CFU/mL）；N为高温处理后菌悬液中的微生物浓度/（CFU/mL）。

1.3.2.2 耐高温腐败菌产蛋白酶能力测定

将耐高温菌株接种于酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，分别测定产生的蛋白酶水解圈及菌落直径，以水解圈直径与菌落直径比值（HC值）[15]初步确定菌株产蛋白酶活性的强弱。

1.3.3 耐高温菌株腐败能力测定

取干制豆杆用无菌水于20～23 ℃水温下浸泡复水4 h，真空包装后121 ℃高温杀菌处理20 min，以获得无菌供试豆杆。供试菌株接种于LB培养液37 ℃培养12 h，并用无菌水调整菌悬液浓度至106CFU/mL。将无菌豆杆置于供试菌株菌悬液中浸泡30 s，用无菌包装袋真空包装，即为接种处理免泡豆杆，以无菌水浸泡30 s并无菌真空包装的豆杆为空白对照。所有样品37 ℃贮藏至腐败后，采集样品进行感官评价，并测定质构特征参数、菌落总数及蛋白酶活力、挥发性盐基氮、pH值等指标，以评价菌株对免泡豆杆的腐败能力。

1.3.3.1 感官评价

本实验感官评价采取100 分制，参考陈平等[16]对豆杆的感官评价方法，由感官评价小组共10 人按照表1的评分标准对实验样品进行评价。

表1 豆杆样品感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Dougan

1.3.3.2 质构特征参数测定

采用物性测定仪，测定样品的硬度、弹性、内聚性、胶着性、耐咀性、回复性等质构特征指标。每组样品分别取3 块，剪成2 cm×2 cm大小样品测定，参考刘建伟等[18]方法并做修正，每块样品选择5个不同位置测定。质构测定条件参数为：P5测试探头，测前速率1 mm/s，测中速率0.5 mm/s，测后速率1 mm/s，应变60%，停留间隔5 s。

1.3.3.3 菌落总数及理化指标测定

参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]对样品进行细菌菌落总数测定。参照GB 5009.228—2016《蛋白酶制剂》[19]进行蛋白酶活力测定，定义40 ℃每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个酶活单位（U）。参照GB/T 23527—2009《食品中挥发性盐基氮的测定》[20]进行挥发性盐基氮（TVB-N）测定。参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》[21]分别对样品pH值进行测定。所有实验均重复3 次。

1.3.3.4 耐高温优势腐败菌腐败能力的定量分析

以TVB-N产量因子Y（TVB-N/CFU）作为各优势腐败菌腐败能力的定量指标[22]，腐败菌的TVB-N产量因子计算方法见公式（2）。

1.3.4 耐高温优势腐败菌分类鉴定

通过形态、生理生化并结合16S rRNA及gyrB基因序列对4 株优势腐败细菌进行分类鉴定。形态特征采用革兰氏染色观察法，生理生化特性利用试剂盒进行测定。

菌株基因组DNA提取：将待测菌株分别使用LB液体培养基37 ℃、140 r/min振荡培养24 h获得新鲜细胞悬浮液，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

1 6 S r R N A扩增采用细菌通用引物：2 7 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）[23]。PCR反应体系为：Master mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL，补水至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 个循环，72 ℃延伸10 min。

gyrB基因扩增采用简并引物，UP1s（5’-GA A G T C A T C A T G A C C G T T C T G C A Y G C N G G N GGNAARTTYGA-3’），UP2rs（5’-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTAT-3’）[24]。PCR反应体系：Master mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL，补水至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min[25]。

扩增产物经1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增片段长度与目的片段长度相同、无杂带后送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行纯化并测序，将测序结果提交到NCBI数据库进行基因序列同源性BLAST搜索比对，选择相似度较高的模式菌株序列，用Clustalx 1.83与MEGA 5.1软件，采用NJ法构建菌株系统发育树。

1.4 数据处理

实验数据采用SPSS 22.0软件进行显著性检验与多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 免泡豆杆中腐败细菌的分离

从MSA、STAA、AMB、CFC、锰盐选择性培养基中，共分离出20 株菌（表2）。葡萄球菌、微球菌与热索丝细菌分离频率较低（0.01%），锰盐培养基上芽孢杆菌分离频率可达98.04%，其菌数对数值可达6.85～7.70（lg（CFU/g）），显著高于其他细菌数量。第1批样品中分离出了DY1a、DY1b两株芽孢杆菌；第2批样品中分离出了DY2a、DY2b、DY2c、DY2d四株芽孢杆菌；第3批样品里分离到1株芽孢杆菌DY3。假单胞菌数最多可达5.5（lg（CFU/g）），第3批样品里分离得到两株假单胞菌DC3a、DC3b。气单胞菌数量波动较大，有1～2 个数量级差距。3 个批次样品中细菌种类相同，仅在数量上有所差异。

2.2 腐败细菌耐高温与产蛋白酶能力

2.2.1 腐败细菌耐高温能力

真空包装免泡豆杆生产上采用90～100 ℃、30 min杀菌处理，仍有产品胀袋腐败现象发生。因此，本研究从分离获得的菌株筛选可耐受110 ℃高温的耐高温菌株。由表3可见，菌株DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DM3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY2d、DY3能耐受110 ℃、20 min的高温处理。

表3 耐高温细菌菌株残活率及其产蛋白酶能力Table 3 Residual rate and protease-producing capacity of the heat-resistant strains

2.2.2 耐高温腐败细菌产蛋白酶能力

采用酪蛋白平板法对可耐受110 ℃、20 min的菌株产蛋白酶能力进行测定，采用蛋白水解圈直径与菌落直径比值（HC值）来评价腐败细菌产蛋白酶能力，结果见表3。菌株DS2、DY3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2d的HC值均高于2，菌株DY1a的HC值最高为3.15；其余菌株产蛋白酶能力相对较弱。

2.3 耐高温优势细菌腐败能力分析

2.3.1 感官评价

通过对菌株耐热处理和产酶能力，确定12 株耐高温优势细菌进行回接处理，验证其腐败能力。

接种菌株后发生腐败的免泡豆杆感官评价结果见表4。通过观察比较，在37 ℃贮藏至第7天时，接种DY1a、DY1b、DY3、DY2a、DS1样品色泽暗淡，质地变软，表面出现黏液和不愉快刺激气味等腐败现象，已达到感官无法接受的程度，感官评分低于50 分；其余样品也开始出现不同程度腐败现象。

表4 接种腐败细菌豆杆贮藏7 d后的感官评价结果Table 4 Sensory evaluation of Dougan inoculated with the 12 heat-resistant isolates after storage at 37 ℃ for 7 days

2.3.2 质构特征参数

表5 接种腐败细菌豆杆贮藏7 d后的质构特性Table 5 In fl uence of inoculation with the heat-resistant isolates on textural parameters of Dougan stored at 37 ℃ for 7 days

由表5可见，与对照组比较，接种DY1a、DY1b、DY2a、DY3菌株的样品硬度显著降低，均在815 g以下，表明接种微生物样品的空间结构发生了较大变化；与对照样品相比，接种DY1a、DY2a菌株的样品弹性值均降低，但与对照差异不显著；除DY1a、DY3的内聚性低于0.60外，其余都在其之上，样品腐败程度与内聚性无显著相关性。空白样品的胶着性为858.73 g，而接种DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的样品胶着性值分别为610.56、729.96、632.58、474.99、592.60 g，均显著低于空白组，表明豆杆腐败后胶着性降低。同样，接种DA2、DS1、DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的样品耐咀性低于空白组，表明腐败导致耐咀性的降低。样品回复性值介于0.13～0.31之间，差异不显著。腐败程度越高，其硬度、弹性、胶着性、耐咀性越低，可以看出DY1a、DY1b、DY2a、DY3腐败较严重。

2.3.3 菌落总数

表6 接种腐败细菌豆杆贮藏7 d后的菌落对数值、TVB-N、蛋白酶活力、pH值Table 6 Colony counts, TVB-N, protease activity and pH of Dougan inoculated with the heat-resistant isolates and stored at 37 ℃ for 7 days

对发生腐败的样品进行细菌总数计数，由表6可知，空白对照豆杆样品菌落总数对数值为5.86，表明样品仍残存有耐高温细菌，如耐热芽孢杆菌。而接种腐败细菌样品菌落总数对数值均大于7.0，其中DY3、DY1a、DY1b三株菌株的菌落总数对数值相对较高，分别为9.60、9.48、9.41，表明这3 株菌在免泡豆杆中的生长繁殖速度相对较快，是产品腐败点的优势菌，更易导致产品腐败发生。

2.3.4 TVB-N

TVB-N主要是由于腐败菌分泌一系列胞外酶，从而引起脱氨、脱羧作用，导致蛋白质分解而形成的产物。在富含蛋白质的免泡豆杆中，TVB-N对产品腐败程度具有重要指示意义。由表6可见，对照组样品TVB-N为10.14 mg/100 g，除了DS1样品外其他数值均高于对照组，即表明实验样品已发生不同程度腐败。接种DY1a、DY1b、DY2a、DY2d、DY3的样品TVB-N均超过30 mg/100 g，即已发生腐败的严重程度高于其他菌株。其中接种菌株DY1a的豆杆样品TVB-N值最高，其次分别是DY1b、DY2a、DY3，结果与样品感官评价基本一致。

2.3.5 蛋白酶活力

由表6可知，除了DA1、DM3外，其他接种豆杆样品均有较高的蛋白酶活力。其中接种DY1a豆杆样品蛋白酶最高，为926.21 U/g。其次依次是接种DY1b、DY3、DY2a、DS2、DA2、DY2c、DA1豆杆样品。样品蛋白酶活力越高，表明该菌株对豆杆大豆蛋白的分解能力越强，腐败程度越高。

2.3.6 pH值

由表6可知，除了DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY3，其他腐败样品的pH值均低于空白对照组。说明接种了以上菌株的腐败样品中蛋白质被微生物分泌的蛋白酶类分解，产生的氨和胺类等碱性含氮物，使样品pH值升高[27]。部分菌株接种样品pH值低于未接种对照样品，是与糖类等营养物质被菌株分解代谢产生有机酸，导致pH值降低有关[28]。

2.3.7 耐高温优势腐败菌致腐能力比较

表7 4 株耐高温优势腐败细菌TVB-N产量因子Table 7 Yield factors of TVB-N of four heat-resistant spoilage strains

由表7可知，4株腐败菌腐败能力大小依次为DY1a＞DY1b＞DY3＞DY2a，与感官评价结果一致。菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3为免泡豆杆的耐高温优势腐败菌。

2.4 腐败细菌鉴定

2.4.1 形态特征与生理生化特性

菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3在PCA平板上37 ℃培养24 h后，菌落均呈圆形或椭圆形，边缘不规则，液体静置培养有菌膜产生。菌株DY1a（图1A）、DY1b（图1B）菌落乳白色不透明，表面干燥；菌株DY2a（图1C）、DY3（图1D）菌落透明，外层有透明圈，表面光滑湿润。4 株菌菌体细胞分别呈长杆和短杆状，革兰氏染色阳性（图1E～图1H）。

图1 4 株耐高温腐败细菌形态特征Fig. 1 Colonial morphology and micrograph of four heat-resistant spoilage bacterial strains

表8 4 株耐高温腐败细菌生理生化特性Table 8 Physiological and biochemical characteristics of four heat-resistant spoilage strains

由表8可知，4 株腐败细菌均可利用葡萄糖、侧金盏醇、木糖、棉子糖，分解尿素；靛基质、葡萄糖酸盐、赖氨酸、鸟氨酸实验结果呈阳性；MR、VP、苯丙氨酸、硫化氢实验结果呈阴性。菌株DY1a、DY1b不能利用山梨醇，菌株DY1a、DY2a不能利用枸橼酸盐。

2.4.2 16S rRNA序列分析

分别以腐败菌株的基因组DNA模板扩增16S rRNA的DNA片段，扩增到大小约1 500 bp的PCR特征性条带。4 株优势腐败菌DY1a、DY1b、DY2a和DY3的16S rRNA测序结果长度分别为1 354、1 425、1 378 bp和1 398 bp。4 株菌与芽孢杆菌属多个近缘种的16S rRNA基因相似性均在99%以上，其中菌株DY1a的16S rRNA（GenBank登录号：KY290587）与暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis KCTC 13613）、死亡谷芽孢杆菌（B. vallismortis DSM 11031）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens NBRC 15535）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis subsp. subtilis str.168）、萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus NBRC 15539）相似性分别为99.85%、99.85%、99.78%、99.63%、99.56%；菌株DY1b的16S rRNA（GenBank登录号：KY290588）与上述对比菌株序列相似性分别为99.44%、99.23%、99.16%、99.44%、99.23%。菌株DY2a的16S rRNA（GenBank登录号：KY290589）与枯草芽孢杆菌（B. subtilis subsp. subtilis str.168）、莫哈韦芽孢杆菌（B.mojavensis NBRC 15718）、B. axarquiensis LMG 22476、B. malacitensis CR-95相似性分别为99.93%、99.71%、99.57%、99.71%；菌株DY3的16S rRNA（GenBank登录号：KY290590）与上述菌株序列相似性分别为100%、99.78%、99.71%、99.78%、99.63%。

图2 基于16S rRNA 序列的4 株腐败细菌系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of four spoilage bacterial strains based on 16S rRNA gene sequences

由图2可知，菌株DY1a、DY1b与暹罗芽孢杆菌、死亡谷芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均在同一分支；菌株DY2a、DY3与枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、B. axarquiensis、B. malacitensis聚在同一分支。细菌16S rRNA序列分析是目前确定细菌分类地位的常用分子生物学手段。由于16S rRNA的高度保守性，对相似率极高的近缘种（如芽孢杆菌属、假单胞菌属等）只能做到属水平上的鉴定，无法进行不同种的有效聚类区分[29-30]。本研究利用16S rRNA序列测序结果构建菌株系统发育树，发现其与芽孢杆菌属的多个种相似度均在99%以上，且聚在16S rRNA系统发育树的同一分支，并不能与其他种的模式菌株明显区分开，因此采用16S rRNA序列并不能将4 株腐败芽孢杆菌准确鉴定到种，不少研究者也得出了相同结论[25-26]。

2.4.3 gyrB基因序列分析

将4 个菌株的基因组DNA为模板扩增gyrB的DNA片段，扩增到大小约1 200 bp的PCR特征性条带。4 株优势腐败菌DY1a、DY1b、DY2a和DY3的gyrB基因测序结果长度分别为1 155、1 155、1 158 bp和1 152 bp。由图3可知，菌株DY1a（GenBank登录号：KY315725）、DY1b（GenBank登录号：KY315726）与解淀粉芽孢杆菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性为100%；菌株DY2a（GenBank登录号：KY315727）、DY3（GenBank登录号：KY315728）和枯草芽孢杆菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性为100%。故将菌株DY1a、DY1b鉴定为解淀粉芽孢杆菌；菌株DY2a、DY3为枯草芽孢杆菌。通过16S rRNA序列很难鉴别出芽孢杆菌的近缘种，gyrB基因是编码细菌DNA促旋酶B亚基（gyrB）的基因，进化速率较16S rRNA基因快，构建的系统发育树分辨率更高，可用于芽孢杆菌属内近缘种的分类鉴定[25-26]。通过gyrB基因序列分析能区分出枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens），并将4 株腐败芽孢杆菌准确鉴定到种。

图3 基于gyrB基因序列的4 株腐败细菌系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of four spoilage bacterial strains based on gyrB sequences

3 讨 论

豆杆是川渝地区一种传统腐竹类非发酵豆制品，目前对其腐败微生物的分离鉴定及其腐败能力的研究鲜见报道。本实验采用选择性培养基从四川隆昌免泡豆杆腐败样品中分离纯化到20 株细菌，其中12 株能够耐受110 ℃、20 min高温处理，且产蛋白酶能力较强。将其接种到无菌免泡豆杆中进行腐败能力分析比较，结果表明导致豆杆发生严重腐败的4 株优势腐败菌均为芽孢杆菌。目前国内外研究结果表明，耐热性芽孢细菌是非发酵豆制品主要腐败菌，主要来源于加工原料[9-10]。此外在各类腐败样品中还存在成团肠杆菌、溶酪葡萄球菌、戊糖片球菌等非耐热细菌[4-11]，由于豆制品加工过程高温煮浆会将大部分非耐热菌杀死，而这类细菌主要来源于生产、包装、储藏等环节的二次污染[10]，只要严格保证生产各环节环境卫生和工艺要求，基本上可避免非耐热菌导致的腐败现象。而来自原料的耐热性芽孢杆菌在常规杀菌条件下很难将其彻底杀死，而采用较强的杀菌条件虽能减少耐热腐败菌的残留，但会对产品质构带来严重破坏，影响感官品质。因此耐热性芽孢类腐败菌的杀菌控制是保证免泡豆杆贮藏品质与安全的关键点和难点。目前控制豆制品微生物污染方法主要有高热杀菌和化学防腐剂处理，考虑维持产品口感与营养成分，应结合非热杀菌技术进行处理来控制其中的耐热芽孢类细菌。

隆昌豆杆以其筋道细腻的口感深受消费者欢迎。豆制品贮藏过程不仅会发生主要营养物质成分的变化，还会导致产品质构特性变化，丧失原有产品良好的口感，感官品质下降[28]。本研究在感官评价结果基础上，对接种腐败菌豆杆样品的质构特性测定结果表明，主要腐败菌导致豆杆硬度、弹性、胶着性、耐咀性等显著降低，与感官评价中发现样品硬度降低、弹性下降，黏度增加等腐败现象及程度相符，表明产品硬度、弹性、胶着性和耐咀性与免泡豆杆腐败后感官品质存在一定的相关性，可与主观感官评价手段相结合评价免泡豆杆品质的优劣。

4 结 论

导致免泡豆杆腐败变质的优势腐败细菌均为芽孢杆菌属，包括2 株解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和2 株枯草芽孢杆菌（B. subtilis）。4 株腐败芽孢杆菌均具有较强的耐高温和产蛋白酶能力，可引起免泡豆杆TVB-N和pH值升高，导致产品硬度、弹性、胶着性、耐咀性降低，其中解淀粉芽孢杆菌DY1a对免泡豆杆腐败能力最强。

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Isolation, Identif i cation and Evaluation of Dominant Spoilage Bacteria from Vacuum-Packaged Nonrehydrated Dougan, a Chinese Traditional Rod-Shaped Soybean Product Prepared with Protein-Lipid Film

ZHENG Lijun, SHEN Guanghui*, ZHANG Zhiqing, LI Chenfeng, CHEN Anjun, LI Shanshan, WU Hejun, LUO Songming
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The purpose of this study was to isolate and identify the bacteria responsible for spoilage of vacuum-packaged nonrehydrated Dougan (a Chinese traditional rod-shaped soybean product prepared with protein-lipid fi lm) and to evaluate the spoilage potential of the heat-resistant bacteria. The bacteria were isolated using various selective media. The dominant spoilage bacteria were identif i ed by morphological observation, physiological and biochemical characterization, and 16S rRNA and gyrB gene sequence analysis. The heat-resistant spoilage bacteria with higher protease-producing capacity were inoculated into sterilized Dougan to evaluate the spoilage potential according to the sensory quality, textural properties,total volatile basic nitrogen (TVB-N) content, protease activity and pH of Dougan. A total of 20 bacterial strains were isolated from spoiled nonrehydrated Dougan, and among these isolates, 12 strains with higher protease-producing capacity could survive autoclaving at 110 ℃ for 20 min. The Dougan inoculated with strains DY1a, DY1b, DY2a and DY3 showed obvious signs of spoilage after storage at 37 ℃ for 7 days. The TVB-N, protease activity and pH value of the inoculated samples were signif i cantly higher than those of the non-inoculated control. Texture prof i le analysis indicated that hardness, springiness, gumminess and chewiness of the inoculated sample decreased significantly compared with control samples. All four specif i c spoilage bacteria belonged to the Bacillus genus. According to the TVB-N yield factors(Y (TVB-N/CFU) values), the spoilage potential of B. amyloliquefaciens DY1a was the strongest among the spoilage bacteria isolated, followed subsequently by B. amyloliquefaciens DY1b, B. subtilis DY2a and B. subtilis DY3.

nonrehydrated Dougan; Bacillus spp.; gyrB gene; spoilage capability; textural properties

10.7506/spkx1002-6630-201802028

TS254.4

A

1002-6630（2018）02-0177-08

2017-02-14

四川农业大学校企合作项目（060H0301）；四川省教育厅川菜发展研究中心重点规划项目（CC2017Z01）；

四川农业大学“双支计划”项目（03572107）

郑丽君（1993—），女，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：ZhengLiJJJ@163.com

*通信作者简介：申光辉（1985—），男，讲师，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：shenghuishen@163.com

郑丽君, 申光辉, 张志清, 等. 真空包装免泡豆杆优势腐败细菌分离鉴定及其致腐能力分析[J]. 食品科学, 2018, 39(2):177-184.

10.7506/spkx1002-6630-201802028. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Lijun, SHEN Guanghui, ZHANG Zhiqing, et al. Isolation, identification and evaluation of dominant spoilage bacteria from vacuum-packaged nonrehydrated Dougan, a Chinese traditional rod-shaped soybean product prepared with protein-lipid fi lm[J]. Food Science, 2018, 39(2): 177-184. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802028. http://www.spkx.net.cn