表面等离子体共振技术分析卵黄抗体对酪氨酸酶与底物相互作用的影响

史佩玉，曹立民，林 洪，隋建新*

表面等离子体共振技术分析卵黄抗体对酪氨酸酶与底物相互作用的影响

史佩玉，曹立民，林 洪，隋建新*

（中国海洋大学食品安全与质量实验室，山东 青岛 266003）

目的：采用表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）测定酪氨酸酶与特异性卵黄抗体（IgY）及其与底物L-多巴的亲和力，探讨特异性IgY对酪氨酸酶与底物亲和力的影响。方法：将裸金芯片进行自组装修饰，以3-巯基丙酸作为基底膜对酪氨酸酶进行固定，SPR实时监测特异性IgY及底物L-多巴与酪氨酸酶结合后芯片表面的响应信号变化。将数据导入CLAMP分析软件，进行拟合分析，确定动力学常数。结果：酪氨酸酶与特异性IgY的结合常数（4.50×106L/mol）明显高于其与底物L-多巴的结合常数（4.95×103L/mol），且酪氨酸酶与特异性IgY结合后，其与底物L-多巴结合常数明显下降。结论：相比底物L-多巴，酪氨酸酶更易与特异性IgY结合，而且从结合动力学角度说明特异性IgY可以明显抑制酪氨酸酶与底物结合从而抑制酶活性。

表面等离子体共振；酪氨酸酶；特异性卵黄抗体；L-多巴；动力学常数

酪氨酸酶是一种分子质量为75 kDa的含铜氧化还原酶，广泛分布于动植物、微生物及人体中[1]。具有双重催化功能，即同时具有单酚酶活性和双酚酶活性，能够催化酪氨酸和多巴发生一系列反应产生黑色素，是生物体合成黑色素的关键酶和限速酶[2-3]。酪氨酸酶是导致新鲜果蔬、对虾等食品发生酶促褐变的主要酶类，其过量表达也是导致人体色素沉着过度等皮肤问题的主要原因[4]。因此，越来越多的酪氨酸酶抑制剂被开发用于果蔬、对虾等食品保鲜，以及治疗常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑等[5-6]。目前常用的酪氨酸酶抑制剂主要有亚硫酸盐、有机酸等化学抑制剂，以及从动植物体内提取的黄酮类、多酚类、糖苷类、醛类等活性物质，但这些抑制剂在操作性、安全性、效果、成本上等方面都存在一定的缺陷[7-8]。

卵黄抗体（IgY）是禽类卵黄中存在的唯一一种免疫球蛋白，是禽类B淋巴细胞在特定抗原刺激下产生并转移到卵黄中形成的多克隆抗体[9-10]，具有纯度高、含量大、易提取、特异性高、稳定性好、耐酸耐热、无毒无害等优点[11]，而且不激活哺乳动物及人体的补体系统、不结合类风湿因子，可有效避免检测中出现假性结果[12]，此外特异性IgY与免疫抗原特异性结合后，能显著抑制免疫抗原的活性[13]，针对这些特性，IgY在免疫检测、功能性食品开发、疾病的诊断与防治等方面有着广泛应用[14]。

本实验室的前期研究证实，酪氨酸酶特异性IgY能够显著抑制酪氨酸酶的活性，但对于抗原和抗体之间的结合是通过免疫吸附技术间接测定的，没有直观分析抗原抗体之间的相互作用。而表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）可通过检测附着在传感芯片表面的介质层的折射率与厚度改变而引起反射光的折射率等光谱变化来分析检测生物分子相互作用[15]。自1983年Liedberg等[16]引入SPR技术进行免疫分析，SPR技术因具有样品用量少、灵敏度高、样品无需标记、实时快速、对分析物活性无影响等突出优点[17]而迅速发展，目前已广泛应用于医学免疫检测、环境监测、药物开发和食品安全检验等多个领域[18]。

本研究利用SPR技术直观分析酪氨酸酶与特异性IgY结合的动力学过程，并探究特异性IgY对于酪氨酸酶与底物作用的影响，为特异性IgY作为新型酪氨酸酶抑制剂的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪氨酸酶、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、盐酸乙醇胺 美国Sigma公司；过氧化氢（30%）、硫酸（98%）、2-N-吗啡啉乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）、3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA）、无水乙醇上海晶纯试剂有限公司；酪氨酸酶特异性IgY由本实验室制备并经免疫亲和纯化得到。

1.2 仪器与设备

Biosuplar 400 SPR仪 德国Mivitec公司；BT100-2型微量蠕动泵 保定齐力恒流泵有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

酪氨酸酶、特异性IgY用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）配制成一系列质量浓度的溶液；EDC、NHS用MES（pH 6.0）缓冲液配制，浓度分别为0.2、0.05 mol/L，使用时二者按体积比1∶1混合；98%浓硫酸与30%过氧化氢按体积比3∶1配制为芯片洗液。所有溶液均使用超纯水配制，0.22 μm滤膜过滤处理，使用前超声脱气。

1.3.2 芯片自组装处理与酪氨酸酶的偶联固化

采用自组装膜技术，将芯片洗液浸泡处理的裸金芯片用0.3% MPA的无水乙醇溶液4 ℃条件下过夜处理12 h，在金膜表面自组装一层巯基单分子膜[19]，然后通过0.2 mol/L的EDC溶液和0.05 mol/L的NHS溶液等体积混合溶液常温活化1 h。活化后的芯片安装入仪器，设定流速为35 μL/min，通入20 mg/mL酪氨酸酶在活化的传感片表面进行偶联固定，然后用0.25 mol/L盐酸乙醇胺封闭未反应的活化酯，再用PBS洗去非共价吸附的酪氨酸酶及乙醇胺。以相同活化条件下表面没有固定酪氨酸酶的芯片作为空白参比。

1.3.3 动力学测定

PBS（pH 7.4）作为流动缓冲液以恒定流速（流速35 μL/min）流过传感片表面，测定相互动力学时，分别将对应的特异性IgY或底物L-多巴用PBS（pH 7.4）稀释成不同质量浓度，分别通入到已固定酪氨酸酶的传感片上。每个循环包括PBS背景采集、抗体结合和抗体解离3个阶段。测定每一质量浓度后，用再生溶液pH 2.7的甘氨酸-盐酸溶液再生传感片，然后进行下一次测定[20]。

同样方法测定酪氨酸酶与特异性IgY复合物与底物L-多巴的相互作用动力学。反应在25 ℃、pH 7.4、流速35 μL/min条件下进行，实验所得的实时传感曲线，导入到分析处理软件CLAMP进行拟合，得相互作用的动力学参数。

2 结果与分析

2.1 芯片自组装处理与酪氨酸酶的偶联固定

SPR被广泛应用于研究分子间相互作用，平面偏振光以合适角度入射到棱镜表面的金膜，即两种不同折射率的介质界面，发生全反射，渗透到金膜内的消失波引发金属中的自由电子产生表面等离子体，当二者的频率和波数相等时产生共振，光能被吸收，反射光能量急剧下降，出现反射强度最低值（即共振峰），此入射角即为SPR共振角[21]。金膜表面被修饰后折射率发生变化，共振峰的位置（SPR共振角）将发生改变，从而获得被测物在芯片表面结合反应的信息[22]。

图1 芯片表面修饰与酪氨酸酶固定原理示意图Fig. 1 Schematic demonstration of chip modif i cation and tyrosinase immobilization

SPR芯片主要由玻璃基片、金膜以及偶联在上面的探针构成，本研究所使用的裸金芯片，只在玻璃基片上蒸镀一层50 nm的金膜，表面疏水性强，难以直接偶联蛋白质分子，通过含硫化合物可以在金膜表面自组装形成薄而有序的单分子层[23-24]。以MPA对裸金片进行12 h的自组装，MPA以Au—S键共价结合在金膜上，而另一端的羧基（—COOH）经活化剂活化后，可与蛋白质分子的氨基（—NH2）发生脱水反应形成酰胺键，从而将蛋白质分子牢固地偶联在芯片表面[23]（图1）。芯片修饰前后的SPR响应如图2所示，可以明显看出，芯片修饰后的共振角与SPR响应信号都明显增大，表明裸金片表面已经成功固定MPA。

严格来说，此次参与的车型并非都是超级跑车。其中，阿斯顿·马丁Vantage就更适合长时间在欧洲大陆的公路上进行巡航，而非是在赛道上左摇右摆。严格意义上来说，它仍旧属于传统的运动跑车范畴。除此之外，奥迪R8 RWS也有类似的问题。即将面临换代的奥迪R8似乎吸引力并没有那么大，但回忆以往R8带给我们的丰富乐趣，我们又不愿意将这辆R8 RWS留在出发地的停车场，让它独享寂寞。

图2 芯片修饰前后SPR图谱Fig. 2 SPR curves of sensor chip before and after modif i cation

图3 芯片表面固定酪氨酸酶SPR实时传感图Fig. 3 SPR real-time curve for tyrosinase immobilized on the sensor chip surface

本研究拟固定的酪氨酸酶本身是一种蛋白质，可通过其自身氨基与芯片表面羧基的缩合反应固定在修饰后的芯片上，固定过程如图3所示。酪氨酸酶在芯片表面固定后，PBS流过芯片表面时，信号有一定程度的下降，这是由于芯片表面物理吸附或结合不牢固的物质被洗脱下来所导致的，因此在每次测定结合反应之前，需先用PBS流经芯片，获得平稳基线后再进行实验测定。酪氨酸酶固定稳定后SPR响应信号上升了约60 RU，根据Stenberg等[25]结论，对蛋白来说，SPR信号响应值增加1 000 RU，相当于表面固定量增加1 ng/mm2。因此计算可得本实验中固定的酪氨酸酶量约为0.06 ng/mm2。

2.2 动力学测定结果

2.2.1 酪氨酸酶与特异性IgY及底物L-多巴的动力学分析

图4 酪氨酸酶与不同质量浓度特异性IgY的SPR结合曲线Fig. 4 SPR curves of tyrosinase binding to different concentrations of specif i c IgY

图5 酪氨酸酶与不同质量浓度L-多巴的SPR结合曲线Fig. 5 SPR curves of tyrosinase binding to different concentrations of L-dopa

固定后的酪氨酸酶可与特异性IgY通过抗原抗体的特异性识别产生结合，同样也可与L-多巴通过底物识别产生结合，SPR动态测定其结合过程如图4、5所示。每个反应过程都包含结合、平衡、解离3 个阶段，无论是特异性IgY还是L-多巴，随着反应质量浓度的增加，结合信号也逐渐升高，说明结合量增大。对比可发现酪氨酸酶与特异性IgY的结合量比与底物L-多巴的结合量更大，且相同结合量所用的特异性IgY质量浓度（0.1 mg/mL）比L-多巴的质量浓度（4.5 mg/mL）要小的多。

本实验采用微量蠕动泵作为传输系统，各种溶液可以以恒定流速（35 μL/min）流过芯片表面，因此流经芯片表面的特异性IgY和L-多巴质量浓度可以认为保持恒定，其与固定的酪氨酸酶的相互作用可以看作是一级反应，符合下列反应方程式[26]：

式中：ka为结合速率常数/（L/（mol·s））；kd为解离速率常数/s-1；c为溶液中样品的浓度/（mol/L）；Rmax为酪氨酸酶的表面最大结合容量/RU；R为时间t时的SPR信号/RU。

结合常数KA和解离常数KD可以由结合和解离速率常数[27]求得：

将所得的实时SPR传感图，分别导入到分析软件Clamp XP，选择相互作用分子比为1∶1 Langmuir的作用模式，对浓度测定计算方法进行拟合。所得的拟合结果动力学常数ka和kd、亲和常数KA和KD见表1。

表1 特异性IgY和底物L-多巴与酪氨酸酶相互作用的动力学常数Table 1 Kinetic constants for the interaction of tyrosinase with speci fi c IgY and the substrate L-dopa

2.2.2 IgY对酪氨酸酶结合底物能力影响的动力学分析

实验室前期研究表明，特异性IgY与酪氨酸酶结合后，能显著抑制酪氨酸酶的活性，通过测定酪氨酸酶与特异性IgY结合后，再与底物L-多巴结合常数的变化，可从动力学角度分析特异性IgY对酪氨酸酶活性的抑制性能。

本研究分析了不同质量浓度的特异性IgY对酪氨酸酶与底物L-多巴亲和力的影响，考虑特异性IgY以及最低质量浓度L-多巴结合信号的可观测性，特异性IgY质量浓度范围选择0.05～0.25 mg/mL之间。由图6可以看出，酪氨酸酶与特异性IgY结合后，其与底物L-多巴的结合受到显著影响，且随着特异性IgY质量浓度的增加，底物L-多巴的结合量逐渐变小，以最高质量浓度的L-多巴为例，其结合量由未结合IgY时的120 RU依次下降为100、85、70、55、40 RU。这表明IgY与酪氨酸酶特异性结合后能显著影响酶与底物的识别，从而发挥抑制酶活性的作用。

图6 酪氨酸酶与不同质量浓度特异性IgY复合物与不同质量浓度底物L-多巴SPR结合曲线Fig. 6 SPR curves of tyrosinase complexes with different concentrations of speci fi c IgY in the presence of different concentrations of the substrate L-dopa

将所得的实时SPR传感图，分别导入到分析软件Clamp XP，按上述方法进行拟合，所得酪氨酸酶与不同质量浓度特异性IgY结合后与底物L-多巴的动力学常数及计算所得的亲和常数如表2所示。

表2 酪氨酸酶与不同质量浓度特异性IgY复合后与底物L-多巴的相互作用动力学常数Table 2 Kinetic constants for the interaction of tyrosinase complexes with different concentrations of speci fi c IgY with L-dopa

从表2结合动力学和亲和常数可以得出，特异性IgY的加入致使酪氨酸酶与底物L-多巴的结合速率（ka）降低，解离速率（kd）增大，所以导致二者的结合常数（KA）值明显降低，随着特异性IgY质量浓度的逐渐增大，KA值从4.95×103L/mol逐渐降低至183 L/mol，降低了约4 个数量级，进一步确证了特异性IgY对酶活性的抑制作用，这与传统酶活性测定方法的检测结果一致[8]。唯一不同的是采用传统方法测定，0.5 mg/mL的IgY才能对酶活性产生抑制作用，0.1 mg/mL的IgY检测不到其对酶活性的抑制作用；而本研究采用SPR技术在IgY质量浓度为0.1 mg/mL即可明显检测到酶与底物结合能力的变化，检测灵敏度大大提高，这可能是因为SPR所用的Au-S体系自组装膜的化学修饰法比传统的酶联免疫吸附测定利用物理吸附直接固定法具有更高的稳定性和更好的特异性[30]。

3 结 论

本实验利用SPR技术从动力学角度分析IgY与酪氨酸酶的相互作用及其对抗原活性的抑制效应，通过拟合分析得到的动力学常数研究了特异性IgY对酪氨酸酶与其底物相互作用的影响，从动力学角度实时分析IgY对酪氨酸酶活性的抑制效应，结果表明，SPR技术与传统的酶活性检测方法结果一致，方法的灵敏度较传统酶活性测定方法大大提高，且能够实时、快速监测反应过程，可作为一种有效分析抗原抗体相互作用的手段应用与IgY的相关性质研究，为下一步IgY的性质鉴定和分子改造提供了重要的分析测试手段。

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Impact of Specif i c IgY on the Interaction between Tyrosinase and Its Substrate Analyzed by Surface Plasmon Resonance

SHI Peiyu, CAO Limin, LIN Hong, SUI Jianxin*
(Food Safety and Quality Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Aim: Surface plasmon resonance (SPR) was used to investigate the impact of specif i c egg yolk immunoglobulin(IgY) on the interaction between tyrosinase and its substrate L-dopa. Methods: Bare gold chip was modified by selfassembly. 3-Mercaptopropionic acid (MPA) was used as the basement membrane to immobilize tyrosinase, and the SPR response signals of tyrosinse binding to specif i c IgY and L-dopa were monitored in real time. The CLAMP software was used to fi t the experimental data to determine the kinetic constants. Results: The aff i nity constant of tyrosinase to specif i c IgY (4.50 × 106L/mol) was higher than that to L-dopa (4.95 × 103L/mol), and after binding to specif i c IgY, the binding constant between tyrosinase and L-dopa was decreased significantly. Conclusion: Compared with the substrate L-dopa,tyrosinase was more likely to specifically bind to IgY, and the specific IgY could significantly inhibit the binding of tyrosinase to its substrate and consequently inhibited the enzyme activity on the basis of binding kinetics.

surface plasmon resonance (SPR); tyrosinase; specif i c IgY; L-dopa; kinetic constants

10.7506/spkx1002-6630-201802025

TS201.1

A

1002-6630（2018）02-0158-05

史佩玉, 曹立民, 林洪, 等. 表面等离子体共振技术分析卵黄抗体对酪氨酸酶与底物相互作用的影响[J]. 食品科学,2018, 39(2): 158-162.

10.7506/spkx1002-6630-201802025. http://www.spkx.net.cn

SHI Peiyu, CAO Limin, LIN Hong, et al. Impact of specif i c IgY on the interaction between tyrosinase and its substrate analyzed by surface plasmon resonance[J]. Food Science, 2018, 39(2): 158-162. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802025. http://www.spkx.net.cn

2017-01-12

山东省农业应用创新专项（931566010）；中央高校基本科研业务费专项（201413061）

史佩玉（1992—），女，硕士，研究方向为水产品质量控制。E-mail：shipeiyudecom@163.com

*通信作者简介：隋建新（1981—），男，副教授，博士，研究方向为水产品安全质量控制。E-mail：suijianxin@ouc.edu.cn