家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因的克隆、序列分析及表达模式

魏川川，修江帆，胡 亚，尚小丽，张迎春，吴建伟

(1.贵州医科大学基础医学院，贵阳 550004；2.贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004)

家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因的克隆、序列分析及表达模式

魏川川2，修江帆1*，胡 亚1，尚小丽1，张迎春1，吴建伟1

(1.贵州医科大学基础医学院，贵阳 550004；2.贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004)

对家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因SP2、SP13和SP16进行克隆、序列分析和时空表达模式检测。运用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)等有关的生物信息学分析工具，预测和分析3条Serpin基因编码蛋白质的结构与生物学功能。以RPS18(核糖体S18蛋白)为内参基因，采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测3条Serpin基因在家蝇不同发育时期，以及家蝇3龄幼虫中脂肪体、唾液腺、中肠、马氏管和体壁的表达特征。SP2、SP13、SP16基因序列的开放阅读框ORF全长分别为1191 bp、1137 bp和1212 bp，分别编码含396、378和403个氨基酸残基的蛋白质，其理论分子量分别为45315.3 Da、43701.5 Da和45011.5 Da，等电点分别为9.01、5.98和6.04，蛋白质的N端都含有一段信号肽，并具有Serpin基因的保守结构域，属于Serpin家族。SP2和SP16在蛋白质的C端含反应中心环(Reactive center loop，RCL)，而SP13 C端不含RCL。时空表达模式分析结果显示，SP2基因在2龄幼虫中的表达量最高，而雄蝇的表达量与卵期相比有所下调；SP13基因在蛹中的表达量最高，1龄幼虫和雌蝇中的表达量与卵期相近；SP16基因在2龄幼虫和3龄幼虫中的表达量最高，雄蝇与雌蝇的表达量与卵期相比有所下调。在家蝇3龄幼虫的各主要组织中，以体壁为参照，SP2基因在唾液腺表达水平最高，其次是脂肪体，中肠和马氏管均低于体壁；SP13基因在马氏管和脂肪体中的表达水平最高，中肠和唾液腺的表达量低于体壁；SP16基因在唾液腺、中肠、脂肪体和马氏管的表达量均低于体壁。推测Serpin基因在家蝇个体发育和免疫调节中起不同作用。

家蝇；丝氨酸蛋白酶抑制剂；克隆；时空表达；生物信息学

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，Serpin)是蛋白酶抑制因子中最大也是最重要的超家族(Singh and Jairajpuri，2014)。Serpin主要是通过使用自杀底物原理特异性地与靶酶形成稳定的共价复合物,导致靶酶失活，终止过度免疫应答反应，对宿主本身起着免受损伤的作用。它们是一类单链蛋白质，广泛存在于动物、植物和微生物体中，是一族能折叠形成保守的空间三维结构且具有特异性的类自杀性底物抑制机制的蛋白酶抑制剂，一般包含350-500个氨基酸残基，序列同源性约为30%，疏水区的同源性为70%(Rubyetal.，2006)左右。有抑制活性的Serpin是由蛋白主体和暴露在蛋白主体外的反应中心环(reactive center loop，RCL)组成的，Serpin的核心结构域极为保守,通常包含有3个β-折叠和8-9个α-螺旋，β-折叠命名为sA-sC，α-螺旋命名为hA-hI。RCL位于β片层A和C之间，暴露在Serpin的蛋白主体之外,将其分为20个家族，大多数是糖蛋白，为丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有免疫调节活性(黄薇和吴坤陆，2010；杨伟克等，2014；赵丽芳等，2016)；另一些家族成员因失去了原有的丝氨酸蛋白酶抑制活性，从而在动物体中行使结合蛋白的功能，它是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调将会导致多种疾病产生，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病(张兵等，2014；李冰等，2016)。如血液凝固、基质重建、纤溶、补体形成、蛋白质折叠、激素形成转运、细胞迁移分化、血压调节和肿瘤抑制等生理功能都与其相关(Gattoetal.，2013)。此外，还参与机体多种天然免疫应答的调节。鉴于其重要的免疫调节与生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的青睐，同时如何将其更好地应用于医药也成为国际研究的热点。

家蝇Muscadomestica属于双翅目Diptera蝇科Muscidae家蝇属Musca，孳生环境复杂，携带有许多病原菌，传播疾病，且自身不会被感染，是重要的媒介昆虫，其强大的免疫防御机制日益引起研究者们的关注。为深入研究家蝇这种独特免疫防御机制，本研究对家蝇3种Serpin基因及其编码的蛋白质结构和特征进行了生物信息学分析，并进行克隆、时空表达模式的研究，这为进一步研究Serpin基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试昆虫

家蝇，由贵州医科大学寄生虫教研室保种、传代繁殖，家蝇幼虫经麦麸进行饲养，家蝇成虫以白糖和奶粉按1 ∶1比例混合饲养，另配无菌蒸馏水饲养，蒸馏水与白糖和奶粉的混合物应尽量隔开，避免其污染。饲养条件：温度28℃，相对湿度65%，光照周期10 L ∶14 D，家蝇3龄幼虫均重25.5 mg。

1.1.2质粒和菌株

pMD18-T Vector为克隆载体，购于宝生物工程(大连)有限公司，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell为克隆感受态细胞，购于北京全式金生物技术有限公司，E.coli-DH5α由贵阳医学院病原生物学实验室常规保存。

1.1.3主要试剂及设备

分子量标准DNA marker DL2000，RNAiso Reagent(Total RNA提取试剂)，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit，DNA凝胶回收试剂盒质粒、氨苄青霉素、rTaq酶、DNA快速提取试剂盒(均购自宝生物大连TaKaRa公司)；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)、琼脂粉、琼脂糖(sigma公司)；溴化乙啶(EB)溶液、甘油(Glycerol)(贵州鼎国生物技术有限责任公司)；50×TAE电泳缓冲液(上海生工)，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，焦碳酸二乙酯(DEPC)，RNA保护剂(大连宝生物TaKaRa公司)；氯仿、异丙醇、无水乙醇等(成都金山试剂公司)；固相RNase清除剂(Surface RNase Erasol)(北京天恩泽基因科技有限公司)。显微解剖镜(尼康)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；ABI7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Allegra 64R冷冻高速离心机(美国BECKMAN公司)；超低温冰箱(日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1总RNA提取及cDNA合成

总RNA抽提按照TAKARA公司的RNAiso PLUS说明书进行操作，包括家蝇不同发育时期和家蝇3龄幼虫不同组织间的RNA的提取。总RNA经电泳检测，GeneQuant公司核酸定量分析仪测定A260/A280比值及浓度，选取A260/A280的比值范围为1.80-2.00的样本，以1 μg总RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA模板。

1.2.2家蝇Serpin基因克隆的引物设计及基因扩增

根据家蝇的基因组序列筛选到3条家蝇Serpin基因编码序列的ORF，GenBank登录号分别为：XM_005177750.1、XM_005179781.1、XM_005187352.1，利用Primer 5.0和DNA Club软件分别进行引物的设计，SP2F:5′-ATGGGTACCAATGGTGAAACGG CT-3′，SP2R:5′-TTACGTCGACATTCCGGCAAAAG TTCCC-3′,SP13F:5′-ATGGAAGTGTTGAGTAAAG TAC-3′,SP13R:5′-TTACAATGATACAACATGGC C-3′,SP16F:5′ATGACTATAGCCCCCTCAGAAATG GC-3′,SP16R:5′-TCAAAACTTTGAAACATGACC GGC-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR循环参数为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；60℃退火90 s；72℃延伸60 s，35个循环；72℃总延伸10 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，鉴定产物特异性及分子量大小，并用DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化目的产物。将其纯化后的PCR产物亚克隆入pMD18-T载体，阳性克隆送上海生工生物公司测序鉴定。

1.2.3运用生物信息学分析软件对Serpin基因进行分析

利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expert Protein Analysis System, ExPASy, http://ca.expasy.org/)提供的生物信息学工具分析家蝇Serpin基因的特点；运用NCBI Blast对基因序列进行同源比对，用ProtParam分析蛋白等电点、分子质量；ProtScale分析蛋白质的疏水性；Singl P4.1进行信号肽预测；免疫表位数据库分析资源IEDB Analysis Recource网站(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)分析抗原表位；利用EMBL-EBI的在线分析工具InterProScan分析蛋白保守结构域以及活性位点；利用Clustal W和MEGA 5.1软件进行序列同源比对以及采用邻接法构建Serpin基因分子系统进化树。

1.2.4实时荧光定量PCR引物的设计与基因扩增

采用Primer 5.0软件，根据家蝇3种Serpin基因cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物，扩增片段大小分别为162 bp、106 bp、257 bp，以RPS18为内参基因，扩增片段大小为337 bp，SP2-F:5′-CCAAATCAGGCAGTAAATG-3′，SP2-R:5′-CTCAGCAGGTATGGGTAAT-3′，SP13-F:5′-GCTCT ATTGTGGTGCCTAT-3′，SP13-R:5′-ATCCGATGTC ATTTTGG-3′，SP16-F:5′-TCAACAACTGGGTGGA GG-3′，SP16-R:5′-CAAGACTTTGGCATCGTAT-3′，RPS18-F:5′-AAGGGTGTGGGTCGCCGTT-3′，RPS18-R: 5′-GCAATGGGTTGGAGATGAT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应条件：95℃ 35 s，95℃ 5 s，60℃ 35 s，60℃ 30 s，40个循环。

1.2.5实时荧光定量PCR的结果分析

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，收集数据进行分析，采用比较CT值法，确定特定荧光域值对应循环数的CT值，对目标基因进行相对定量分析，采用SPSS 18.0进行统计学分析。发育时期的结果以卵期作为参照进行对比，组织的以体壁作为参照进行分析。

2 结果与分析

2.1 家蝇Serpin基因的扩增和克隆

现将筛选到的具有潜在免疫调节功能的3条Serpin基因序列，通过设计合成的上、下游引物扩增出目的基因片段，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，SP2、SP13、SP16的PCR产物分别在1191 bp、1137 bp、1212 bp左右有一特异性条带(图1)，这与预期的片段大小相一致，并进行了TA克隆，挑选的阳性克隆经测序与目的基因序列相一致，最终筛选的这3条Serpin基因序列分别为SP2、SP13、SP16，并且将其登陆到GenBank，获得的登录号分别为KJ872511.1、KJ872490.1、KJ872492.1。

图1 家蝇3种Serpin的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Agarose gel analysis of three Serpin from housefly larvae1，DL2000 DNA Marker；2，SP2的PCR产物；3，SP13的PCR产物；4，SP16的PCR产物。1,DL2000 DNA Marker; 2, The PCR product of SP2; 3, The PCR product of SP13; 4, The PCR product of SP16.

2.2 家蝇Serpin基因的生物信息学分析

通过NCBI的Blastn在线分析工具对家蝇3种Serpin基因的cDNA序列进行比对分析，结果显示3种Serpin基因都属于Serpin超家族，都具有Serpin基因的保守结构域，并且Serpin2和Serpin16还具有中央反应环RCL，这是能够被靶酶特异性识别的位点。

蛋白质的理化性质：家蝇SP2、SP13、SP16基因cDNA序列的ORF全长分别为1191 bp、1137 bp、1212 bp，分别编码396、378、403个氨基酸，基因编码蛋白的理论分子量分别为45315.3 Da、43701.5 Da、45011.5 Da，等电点分别为9.01、5.98、6.04。若其成熟肽N端为蛋氨酸时，在哺乳动物红细胞体外表达的半衰期为30 h，在酵母和大肠埃希菌中体内表达的半衰期分别>20 h和10 h。SP2蛋白的不稳定指数为39.98，低于域值40，说明该蛋白质在溶液中性质稳定；SP13蛋白的不稳定指数为41.73，高于域值40，说明该蛋白质在溶液中性质不稳定；SP16蛋白的不稳定指数为30.52，低于域值40，说明该蛋白质在溶液中性质稳定。SP2、SP13、SP16蛋白的疏水指数分别为84.77、92.65、84.76，总亲水性分别为-0.210、-0.200、-0.209，蛋白质总体疏水性均较高。

运用ExPASy中的Signal P4.1在线分析可知，SP2基因编码蛋白质的第1-25位氨基酸为信号肽，SP13基因编码蛋白质的第1-20位氨基酸为信号肽，SP16基因编码蛋白质的第1-24位氨基酸为信号肽，均属于分泌型蛋白。

抗原表位分析：运用IEDB Analysis Resource中B Cell Epitope Prediction Tools分析预测3种Serpin氨基酸序列的B细胞抗原表位结果显示，SP2氨基酸序列中4个分值较高的线性表位分别位于aa46-aa53(TESKSQNT)、aa70-aa80(GTN GETADEIE)、aa84-aa96(RQYNNGEADIPDK)和aa197-aa216(PIPAEGMQEKPFRVSPTSRV)；SP13氨基酸序列中4个分值较高的线性表位位于aa21-aa25(NPVVE)，aa67-aa70(GYTA)，aa127-aa130(PFHS)，aa336-aa339(ESDA)；SP16氨基酸序列中9个分值较高的线性表位分别位于aa22-aa33(TTAGTIAPSEMA)、aa71-aa79(TGADGEAAQ)、aa90-aa97(GDKRQVAK)，aa150-aa160(VNFHNSQETIQ)、aa165-aa173(WVEEQTENK)、aa179-aa187(QPGSVDGTT)，aa233-aa242(KFQYGEFPKY)、aa335-aa342(PASQKVSD)和aa353-aa360(EAGSEAAA)。SP2与SP16两者之间在aa71-aa79和aa90-aa96序列均有明显表位，SP13与SP16两者之间在aa22-aa25和aa336-aa339序列均有明显表位，但是其氨基酸不一致，仅个别氨基酸相同。

2.3 家蝇Serpin系统进化树的构建

从NCBI上下载各物种的已知功能的Serpin氨基酸序列，其物种的来源主要有昆虫纲双翅目的果蝇Drosophilamelanogaster，舌蝇Glossinamorsitansmorsitans及冈比亚按蚊Anophelesgambiae，鳞翅目的家蚕Bombyxmori及烟草天蛾Manducasexta，鞘翅目的黄粉虫Tenebriomolitor及赤拟谷盗Triboliumcastaneum，还有哺乳纲啮齿目的小家鼠Musmusculus。采用邻接法构建了系统进化树，并计算了它们之间序列的相似性，利用MEGA 5.1软件对这些Serpin基因进行了分子系统学分析，在构建系统进化树的基础上研究了家蝇3种Serpin的分类归属及其与其他物种Serpin之间的进化关系。从构建的系统进化树(图2)的结果中显示，家蝇SP16与果蝇的Serpin43Aa的遗传距离较近,其次家蝇SP13的遗传距离也比较靠近果蝇的Serpin43Aa；而家蝇SP2与黄粉虫的SPN40和SPN48遗传距离较近。由于家蝇的SP2、SP13、SP16基因与其他物种报道的Serpin基因具有免疫和生理功能相关，最终筛选了这3条具有潜在免疫调节功能的Serpin基因进行了相关研究。

图2 系统进化树分析Fig.2 Analysis of phylogenetic tree

2.4 家蝇3种Serpin基因时空表达的差异

2.4.1家蝇3种Serpin基因在家蝇不同发育时期的表达情况

家蝇3种Serpin基因在家蝇卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、雌蝇和雄蝇各生长发育阶段均显现出差异表达。家蝇SP2基因在2龄幼虫中的表达量最高，其表达量程度从大到小依次排列为：2龄幼虫>1龄幼虫>3龄幼虫>蛹>雌蝇>卵>雄蝇；家蝇SP13基因在蛹期中的表达量最高，其表达量程度从大到小依次排列为：蛹>3龄幼虫>雄蝇>2龄幼虫>1龄幼虫>雌蝇>卵；家蝇SP16基因在2龄幼虫和3龄幼虫中的表达量最高，其表达量程度从大到小依次排列为：2龄幼虫>3龄幼虫>蛹>1龄幼虫>卵>雄蝇>雌蝇(图3)。

2.4.2家蝇3种Serpin在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达情况

家蝇3种Serpin基因分别在家蝇3龄幼虫主要组织中表达量情况，以体壁作为参照，家蝇SP2基因在唾液腺表达水平最高，其在各组织表达量从大到小依次为：唾液腺>脂肪体>体壁>中肠>马氏管；家蝇SP13基因在马氏管和脂肪体中的表达水平最高，在各组织表达量从大到小为：马氏管>脂肪体>体壁>唾液腺>中肠；家蝇SP16基因在体壁中的表达水平最高，在各组织表达量从大到小依次为：体壁>马氏管>中肠>唾液腺>脂肪体(图4)。

图3 家蝇3种Serpin基因在生活史不同发育阶段的表达差异Fig.3 Variation in expression of three Serpin gene in the life cycle of housefly

图4 家蝇3种Serpin基因在3龄幼虫不同组织部位的表达差异Fig.4 Variation in expression of three Serpin gene in different tissues of housefly

3 结论与讨论

家蝇是一种世界性广泛分布的一类媒介昆虫，孳生环境及其复杂，鲜见病原微生物自身感染现象，这将归功于其独特、强大的先天性免疫系统。而丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor，Serpin)作为其调节先天性免疫系统的重要调控因子，在免疫系统调控作用中发挥重要的作用。

本研究根据NCBI上公布的家蝇全基因组预测序列以及课题组前期工作中构建的家蝇3龄幼虫热胁迫cDNA文库(刘红美等，2010)筛选出了3条具有潜在免疫调节功能的Serpin基因，成功克隆了这些基因的cDNA序列，并已上传登陆至GenBank，获得了相应的登录号。通过构建系统发育树对这些Serpin基因分析表明，家蝇SP16和SP13与果蝇Serpin43Aa的亲缘关系最为接近，果蝇Serpin43Ac(Greenetal.，2000)发挥作用的原理和果蝇Serpin43Aa是一致的，而果蝇Serpin43Aa基因对于机体抵抗外界微生物感染中起到非常重要的作用，当机体发生过度免疫时，可通过抑制作用阻断Toll信号通路的信号传递，进而终止过度的免疫反应，从而避免机体损伤。家蝇SP2与黄粉虫SPN40和SPN48亲缘关系最为相近，而鞘翅目昆虫黄粉虫中已经证实SPN40、SPN48和SPN55为黄粉虫天然免疫的重要负调控因子(Jiangetal.，2009)。这为以后研究家蝇SP2、SP13、SP163基因的生物学功能提供了很好的思路。

实时荧光定量PCR(Yeonimetal.，2014；Hidetoetal.，2015；王玉倩和薛秀花，2016)结果表明，家蝇SP2、SP13和SP16在家蝇的卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、雌蝇和雄蝇各生长发育阶段均有不同程度的表达。家蝇SP2基因在2龄幼虫表达量是最高，其次是1龄幼虫和3龄幼虫，在雄蝇阶段表达量是最低；家蝇SP13基因在蛹期表达量是最高，其次是雄蝇、3龄幼虫和2龄幼虫，在卵期、1龄幼虫和雌蝇中表达量是最低；家蝇SP16在2龄幼虫和3龄幼虫表达量是最高，其次是蛹期和1龄幼虫，在卵期、雌蝇和雄蝇中表达量是最低。Bmserpin-6基因在家蚕各个发育阶段均有表达,在4龄眠期、5龄6 d、吐丝48 h(化蛹前)和化蛹6 d的转录水平较高,在5龄 4 d、吐丝初期和蛹末期的转录水平较低(俞燕芳等，2010)。从以上结果分析表明，Serpin基因在家蝇2龄幼虫和3龄幼虫中呈普遍的高表达，而这两个时期也是家蝇整个生长发育时期最活跃、进食最多、生长最快的阶段，推测Serpin基因可能参与了家蝇的个体生长发育，由于进食很多且食物中或多或少存在有一些病原微生物，家蝇幼虫却能正常生长，推测家蝇Serpin基因在抵抗外来的微生物免疫防御过程中发挥着作用。这与本研究结果家蝇SP16与果蝇的Serpin43Aa(Ambadapadietal.，2016)的遗传距离较近，且果蝇Serpin43Aa对于机体抵抗外界微生物感染中起到非常重要的作用相吻合。而家蝇SP13基因在蛹期呈现高表达量，推测家蝇的SP13基因可能在其进行变态发育过程中起着相关作用。棉铃虫Haserpin的mRNA存在于各个组织，但Haserpin在6龄变态时期表达量明显高于幼虫取食期，这暗示Haserpin可能参与变态过程(张凤霞，2010)。

家蝇SP2、SP13和SP16在家蝇3龄幼虫不同组织马氏管、脂肪体、体壁、唾液腺和中肠中均有不同程度的表达。唾液腺是昆虫主要的消化器官，也是昆虫接触食物的第一道防线，其能分泌多种消化酶，研究表明唾液腺在昆虫的免疫防御系统中扮演着重要的角色，而家蝇属于杂食性的昆虫，所进食的食物多含有病原微生物，家蝇SP2基因在唾液腺中高表达，说明可能其在家蝇的免疫防御系统中起着重要作用。家蚕Serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关，推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用(董照明等，2010)。体壁是昆虫直接接触环境的主要组织，也是昆虫自我防御的重要屏障，它是对抗环境伤害的第一道防线，而家蝇生活的环境非常复杂，经常出没于肮脏腐败之地，将自身置身于不计其数的病原菌中，却能安然无恙地生长繁殖，这可能是由于家蝇体壁本身的防御机制以及家蝇强大的免疫防御系统的作用，家蝇SP16基因在体壁中高表达，推测家蝇SP16基因在对抗外来微生物免疫防御中起着重要作用。家蚕Bmserpin-6 mRNA在4龄幼虫的头部、表皮、中肠、丝腺和脂肪体中有转录,其中在表皮中高水平转录(王彦云等，2013)。然而，家蝇SP2、SP13和SP16基因在中肠中表达量都普遍较低，推测可能是由于在中肠内侧存在围食膜(胡小龙和吴小锋，2012；姜姗彤等，2012；Huetal.，2013；Kariuetal.，2013；Jacobetal.，2014)的原因，它是由中肠上皮细胞分泌的非细胞薄膜状结构，根据分泌细胞在中肠所处的位置,可将围食膜分为Ⅰ型和Ⅱ型，主要成份由几丁质和蛋白质组成。因为围食膜是抵制外来微生物侵扰的一道天然屏障，所以在昆虫发育过程中需要不停更新以保证围食膜的完整性和通透性，从而使得昆虫在抵抗外来微生物侵袭的免疫防御过程中起着重要作用。

通过生物信息学分析，有利于全面详细地了解家蝇3种Serpin蛋白的特性、结构、功能等信息；实时荧光定量PCR结果分析，推测家蝇SP2基因在家蝇生长发育过程中起着重要的作用；家蝇SP13基因在家蝇生长发育过程，尤其在蛹期进行变态发育过程中起着重要的作用；家蝇SP16基因主要在免疫防御过程中起着重要的作用。这为以后对于该蛋白的后续研究具有一定的理论指导意义，也为今后研究其生物学与免疫学功能打下坚实的基础。

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Cloning,sequenceanalysisandexpressionpatternofthreeserineproteaseinhibitor(Serpin)inMuscadomestica

WEI Chuan-Chuan2, XIU Jiang-Fan1*, HU Ya1, SHANG Xiao-Li1, ZHANG Ying-Chun1, WU Jian-Wei1

(1. Basic Medical College, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 2. Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China)

To probe into the cloning, sequence analysis and temporal expression patterns of threeSerpingenes inMuscadomestica.SP2,SP13 andSP16 genes were cloned fromM.domestica, and their sequences was analyzed. Expert protein analysis system (ExPaSy) of institute of biological information science in Switzerland and national center for biotechnology information (NCBI) from America, and relevant bioinformatics analysis tool were used to predict and analyze the structures and biological functions of threeSerpingenes. The expression ofSP2,SP13 andSP16 gene were detected by Real-time quantitative PCR (Real Time PCR) technique performed in differential developmental stages, and the expression features in fat body, salivary glands, midgut, markov tube and body wall from three instar larvae ofM.domestica, the RPS18 (ribosomal protein S18) as control. The full-length ofSP2,SP13 andSP16 genes were 1191 bp, 1137 bp and 1212 bp, and they encoded 396 aa、378 aa and 403 aa respectively. The predicted molecular weight ofSP2,SP13 andSP16 were 45315.3 Da， 43701.5 Da and 45011.5 Da, and isoelectric point were 9.01, 5.98 and 6.04,respectively. All of them contained a signal peptide, and the C terminal ofSP2 andSP16 contained a reactive center loop, whileSP13 had not. The spatial and temporal expression patterns showed that the expression of SP2 gene was highest in the second instar larvae, but that was reduced compared with the egg stage, while the expression ofSP13 was highest in the pupa, and the expression of first instar larvae and female similar with the eggs. Besides, the expression ofSP16 gene was highest in the second instar larvae and third instar larvae, but the expression of male and female were reduced compared to the egg stage. The expression of these genes in the major organizations of third instar larvae inM.domesticashowed that the expression ofSP2 was highest in the salivary glands, then in fat body, midgut and Markov tube were lower than that of body wall, the expression in body wall as control; while the expression ofSP13 gene was highest in the Markov tube and fat body, then was body wall, midgut and salivary glands. At last, the expression ofSP16 gene was highest in the body wall, then was fat body, salivary glands, midgut and Markov tube in that order. The results indicated that these genes play different roles in the individual development and immune regulation ofM.domestica.

Muscadomestic; serine protease inhibitor; cloning; temporal expression patterns; bioinformatics

魏川川，修江帆，胡亚，等.家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因克隆、序列分析及表达模式[J].环境昆虫学报，2017,39(6):1334-1341.

Q963

A

1674-0858(2017)06-1334-08

国家自然科学基金(81360254)；黔科合NY[2014]3054号；黔科合LH字[2014]7076；贵州省卫生计生委科学技术基金项目(gzwjkj2014-2-100)

魏川川，男，1987年生，贵州贵阳人，硕士研究生，研究方向为昆虫分子生物学，E-mail：752308241@qq.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: xiujiangfan@163.com

Received: 2016-08-08; 接受日期Accepted: 2016-11-07