基于转录组数据的荔枝蒂蛀虫SSR位点信息分析

2018-01-04胡俊杰李艳华欧阳革成

环境昆虫学报 2017年6期

孟翔，胡俊杰，李艳华，欧阳革成

(1.广东省生物资源应用研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260；2.广州大学生命科学学院，广州 510006)

孟翔1*，胡俊杰2，李艳华2，欧阳革成1

荔枝蒂蛀虫ConopomorphasinensisBradley是专一性危害我国荔枝和龙眼的重要害虫。简单重复序列标记(Simple sequence repeat，SSR)为短串联重复序列或微卫星标记，其在荔枝蒂蛀虫偏嗜选择寄主的遗传进化机制研究和荔枝蒂蛀虫综合治理中具有重要意义。本研究基于高通量测序获得的荔枝蒂蛀虫转录组数据，利用MISA软件从68996条转录组unigenes结果中发掘出10521个SSR位点，出现频率为15.25%。荔枝蒂蛀虫转录组中SSR的主要重复类型为单碱基重复，占SSR总数的66.22%。其次是三碱基重复，占SSR总数的24.94%。在发现的33种重复基元中共筛选获得8种优势重复基元，其中A/T在单碱基重复基元中所占的比例达98.55%。基于筛选的SSR设计的9对引物中，有4对引物得到扩增预期大小的条带。荔枝蒂蛀虫SSR位点的信息分析将为探究荔枝蒂蛀虫种群遗传结构、遗传多样性和进化关系、害虫综合治理等研究提供重要科学依据。

荔枝蒂蛀虫；转录组；简单重复序列；重复类型；重复基元

简单重复序列标记(simple sequence repeat，SSR)，又称为短串联重复序列或微卫星标记。是一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，且广泛均匀分布于真核生物基因组中。由于重复单位的核苷酸不同以及重复次数不完全相同，使SSR长度具有高度的变异性，多态性十分丰富。已广泛应用于遗传图谱和物理图谱的构建、分子标记、辅助育种、品种鉴定、基因定位、遗传多样性、动植物分类和进化等方面的研究(Powelletal.，1996；Varshneyetal.，2005)。目前，随着高通量测序技术的发展，转录组测序为非模式生物SSR标记的大批量开发提供了一种经济、高效的途径，也为非模式昆虫遗传多样性以及环境保护等研究提供了丰富的资源(杨帆等，2014)。

荔枝蒂蛀虫ConopomorphasinensisBradley隶属鳞翅目Lepidoptera细蛾科Gracilariidae，是专一性危害荔枝和龙眼的重要害虫(Thanhetal.，2006；王少山等，2008)。昆虫对寄主的选择和适应性是在长期进化过程中相互协同进化的结果(Karban and Baldwin，1997；钦俊德和王琛柱，2001；Will and van Bel，2006；Walling，2008)。荔枝蒂蛀虫作为一种狭食性昆虫可能代表寄主适应性的一个进化方向，以较低的能量消耗占据有限的资源，从而可以节省大量的能量用于其他方面的进化适应和改善，以提高种群的综合竞争力。然而，目前荔枝蒂蛀虫研究主要集中于基础生物学、生态学以及防治应用等方面(冼继东等，2006；彭海辉等，2006，2007；陈炳旭等，2011)。而关于荔枝蒂蛀虫猖獗危害成因和种群遗传学研究甚少。荔枝蒂蛀虫SSR标记位点的开发有利于构建荔枝蒂蛀虫种群的遗传图谱，从分子水平探究其偏嗜选择寄主的遗传进化机制，对制定科学合理的检测及防控措施具有重要的理论和实践意义。

本研究基于荔枝蒂蛀虫转录组数据库(孟翔等，2016)发掘其功能SSR，对其组成、分布及特征进行系统分析，并对后续的SSR引物进行设计和验证，以期获得荔枝蒂蛀虫遗传多样性和进化关系。研究可为开发荔枝蒂蛀虫功能基因提供有效的SSR分子标记，也为荔枝蒂蛀虫的分子遗传进化研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试虫来源和RNA提取

荔枝蒂蛀虫成虫采集于广东省农业科学院果树研究所荔枝龙眼园。筛选活力充沛的个体，采用Trizol Reagent方法提取荔枝蒂蛀虫总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量；Nanodrop分光光度计(IMPLEN，CA，USA)检测RNA的纯度(OD260/OD280比值)，根据Qubit RNA Assay Kit说明对Total RNA浓度进行精确定量；最后用Agilent 2100(Agilent Technologies，CA，USA)精确检测RNA的完整性。

1.2 转录组测序及序列组装拼接

荔枝蒂蛀虫转录组数据由广东省生物资源应用研究所-虫鼠害生态控制研究中心前期测序获得。主要采用新一代高通量测序技术Illumina HiseqTM4000对荔枝蒂蛀虫进行深度测序。对测序获得的原始reads进行去除带接头、ploy-N和低质量的reads，并采用Trinity软件对clean reads进行拼接、过滤和组装后获得到高质量的unigenes。经测序和序列拼接获得68996条unigenes(孟翔等，2016)。

1.3 转录组SSR分析

利用MISA软件对荔枝蒂蛀虫转录组中的unigene独立基因序列进行SSR位点搜索，对查找的SSR类型进行特征分析。搜索标准为：单碱基重复、二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复、六碱基重复对应的各个unigene的最少重复次数分别为：10、6、5、5、5、5。

1.4 SSR引物设计与验证

基于荔枝蒂蛀虫SSR，应用Primer 3软件(Untergrasseretal.，2012)设计9对SSR引物，并由Invitrogen生物技术有限公司合成。以荔枝蒂蛀虫DNA为模板(具体步骤参见OMEGA Total DNA Kit提取试剂盒说明书)进行PCR扩增。反应体系为25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL；dNTP 2 μL；10×buffer 2.5 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；DNA模板1 μL；ddH2O 17 μL。PCR扩增反应在Eppendorf Mastercycler ep基因扩增仪中进行，SSR的扩增程序为：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增35个循环；最后72℃延伸5 min；反应结束后，取5L反应液进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 荔枝蒂蛀虫SSR位点分布特征

利用MISA软件对荔枝蒂蛀虫转录组进行遗传多样性分析，共在68996条unigenes中搜索获得10521个SSR位点，出现频率为15.25%。这些SSR基序包含1-4 bp的串联重复序列。在荔枝蒂蛀虫转录组SSR的所有碱基重复基元类型中，单碱基重复基元的SSR含量最多，占总数的66.22%。其次是三碱基重复基元，占总数的24.94%。在发现的33种重复基元中，A/T、AC/GT、CCG/CGG和AAAT/ATTT分别在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基中出现频率最多，它们在各自重复基元类型中的比例分别是98.55%、43.24%、65.70%和39.68%(表1)。

表1 荔枝蒂蛀虫转录组SSR重复基元类型及优势重复基元的组成

图1 荔枝蒂蛀虫转录组不同碱基类型的SSR重复次数分布Fig.1 Distribution of SSR repeats among different motif types in Conopomorpha sinensis transcriptome

对不同碱基重复基元的重复次数进行统计发现(图1)，荔枝蒂蛀虫转录组SSR重复基元的重复次数分布在5-24。其中，单碱基重复次数主要集中在9-12，为5599个，占总SSR的53.22%；二碱基、三碱基和四碱基重复次数主要集中在5-8，分别为756、2621和62个，占总SSR的7.19%、24.91%和0.59%；五碱基和六碱基的SSR数量较少，重复次数主要为7和11。

2.2 荔枝蒂蛀虫SSR引物验证与PCR扩增

针对荔枝蒂蛀虫SSR随机设计9对引物(见表2)对荔枝蒂蛀虫DNA进行扩增，结果表明：引物2，3，6，9有明显的扩增条带且与预期目的片段大小接近；引物7，8也有明显扩增条带且小于预期目的片段大小；引物1，5扩增产物有大量非特异性条带产生；引物4没有扩增产物。

表2 荔枝蒂蛀虫筛选SSR引物特征

图2 荔枝蒂蛀虫转录组9个功能SSR位点扩增电泳图Fig.2 Agarose gel showing the amplification of 9 SSR loci in Conopomorpha sinensis transcriptome

3 结论与讨论

目前，基于昆虫转录组数据库筛选功能SSR标记已有许多相关报道，并在非模式生物种群遗传学研究中被广泛应用(Schoebeletal.，2013)。本研究采用生物信息学方法，从荔枝蒂蛀虫转录组中筛选获得10521个SSR位点，出现频率为15.25%。与其它昆虫相比较，荔枝蒂蛀虫SSR出现的频率低于大垫尖翅蝗EpacromiuscoerulipesIvanov 44.17%(金永玲等，2015)，高于扶桑绵粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsleny 6.33%(罗梅等，2014)、烟粉虱BemisiatabaciGennadius 5.07%(Xieetal.，2012)、桔小实蝇BactroceradorsalisHendel 4.23%(魏丹丹等，2014)和粘虫MythimnaseparataWalke 1.93%(胡艳华等，2015)。出现这种频率差异的原因可能是与搜索序列标准、数据库大小和物种的特异性有关，同时从某种程度上也表明荔枝蒂蛀虫转录组中SSR数量较为丰富，多态性潜能较高。

一般认为，短重复基序的大量存在表明该物种的进化水平相对较高(Tóthetal.，2000)，而长重复基序占绝大多数的物种一般具有较低的突变频率或具有较短的进化时间(Siaetal.，1997；Harry and Schlötterer，2000；高亚梅等，2008)。研究发现荔枝蒂蛀虫SSR序列以单碱基重复为主，占总数的66.22%。其次是三碱基和二碱基重复。这与研究报道的在转录组中，除了单核苷酸重复最多以外的是三核苷酸重复的结果是一致的(Xuetal.，2012)。荔枝蒂蛀虫转录组中存在大量短重复基序，表明其在生物进化与分类地位中处于相对较高的进化水平，其遗传基因可能经历了较长的进化时间或具有较高的突变频率。

为验证转录组SSR的多态性和可用性，本研究随机筛选的9对引物中有4对引物可以扩增到预期大小的条带，但仍有5对引物未达到预期扩增或存在明显的非特异性。这可能与扩增片段中插入内含子有关(罗梅等，2014)；也可能是由于本研究所设计引物的SSR序列在基因组中的覆盖率较低，造成扩增产物很少以至于无法被检测到(魏丹丹等，2014)；而对于有些引物的扩增产物具有非特异性条带的情况，很可能是因为这些SSR位于同源基因序列上的缘故。虽然我们对合成的引物进行了验证，但仍需要对设计好的引物做进一步的甄选和遗传多样性分析，以便于更好的开发基于功能SSR的分子标记。

本研究利用荔枝蒂蛀虫转录组数据库，筛选获得大量荔枝蒂蛀虫SSR，并对荔枝蒂蛀虫SSR序列的基本特征和可用性进行了分析和评估，为进一步开发荔枝蒂蛀虫功能基因SSR标记奠定了基础。同时对于荔枝蒂蛀虫功能基因的开发利用、遗传资源评价、丰富其分子标记和比较基因组学研究都具有重要的价值。

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AnalysisofSSRlociintranscriptomedatabaseofConopomorphasinensisBradley(Lepidoptera:Gracilariidae)

MENG Xiang1*, HU Jun-Jie2, LI Yan-Hua2, OUYANG Ge-Cheng1

(1. Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangzhou 510260, China; 2. College of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

ConopomorphasinensisBradley is a major and specific fruit borer pest of litchi and longan in China. Simple sequence repeat, SSR is short tandem repeats or microsatellite. It is important to the genetic evolution mechanism research ofC.sinensispreference for host-plant and its integrated control. Based on the constructed transcriptome database inC.sinensisand the software MISA, 10521 SSR were explored from 68996 transcriptome unigenes, and the occurrence frequency was 15.25%. The majority of repeat type was nucleotide motif (66.22%) and the second was trinucleotide motif (24.94%). A total of 8 dominant repeat motif were screened in 33 kinds of repeat motif. A/T was the most dominant repeat motif (98.55%) in nucleotide motif. Based on the identified SSR, 9 pairs of SSR primers were randomized designed and 4 pairs produced amplification bands in line with expectations. The analysis of SSR inC.sinensissupplys a very important scientific evidence for its population genetic structure research, genetic diversity, evolutionary relationships and integrated control.

ConopomorphasinensisBradley; transcriptome analysis; simple sequence repeat (SSR); repeat type; motif type

孟翔，胡俊杰，李艳华,等.基于转录组数据的荔枝蒂蛀虫SSR位点信息分析[J].环境昆虫学报，2017,39(6):1219-1224.

Q963;S433.4

1674-0858(2017)06-1219-06

国家自然科学基金(31301664)；广东省科技计划项目(2014A020208079，2015A020209091)；广州市科技计划项目(201504290946316)；广东省科学院优秀青年科技人才基金项目(rcjj2015);广东省科学院科技发展专项(2017GDASCX-0107)

孟翔，女，1982年生，山西太谷人，博士，副研究员，研究方向为岭南特色果蔬害虫生物防治，E-mail：mengxiangxs@126.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: mengxiangxs@126.com

Received: 2016-11-03; 接受日期Accepted: 2017-04-18