FID-HPLC法测定木耳中维生素B2的含量

郭航宏，王雪丹，张念洁

维生素B2又叫核黄素（化学式：C17H20N4O6，式量376.37），微溶于水，在中性或酸性溶液中加热亦可保持稳定。为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当维生素B2缺乏时，会影响机体的生物氧化，引发代谢障碍，故维生素B2是维持人体正常生理所必需的物质。维生素B2通常不能在人体内合成，且体内维生素B2的储存极为有限，故须每天通过饮食摄取。黑木耳是一种味道鲜美、营养丰富的食用菌，含丰富的蛋白质、维生素、膳食纤维及铁、钙等微量元素。而黑木耳中维生素B2含量更为蔬菜中其含量的10倍有余，被称为“素中之荤”[1]。目前维生素B2含量常用测定方法有HPLC-PDA、HPLC-UVD、毛细管电泳—激光诱导荧光检测法（CE-LIF）、离子对高效液相色谱检测法及高效液相荧光检测器法（FID-HPLC）[2-5]等。本研究中笔者采用FID-HPLC测定木耳中的维生素B2的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 包括赛多利斯电子天平220S（北京赛多利斯仪器系统有限公司），超声波清洗仪（型号KQ-100B，昆山市超声仪器有限公司），高效液相色谱仪(日本日立公司，包括HITACHI Pump L-2130，HITACHI Autosampler L-2200，Organizer，HITACHI UV-VIS Detector L-2420）。

1.2 试药 维生素B2标准品CAS：BW3601(中国计量科学院提供），木瓜蛋白酶CAS：9001-73-4（上海生物西宝有限公司提供）、高峰淀粉酶CAS号：9004-07-3（上海生物沪宇有限公司提供） ，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件[1，2]色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙酸钠溶液（0.05mol/L）:甲醇=65:35，荧光检测的激发波长462nm，发射波长522nm，流速：1mL/min，进样量：20μL，柱温：室温。

2.2 对照品溶液制备[3，4]精密称维生素B2对照品0.0025mg，置于25mL棕色容量瓶中，先用部分流动相溶解，超声10min，冷却至室温，用流动相定容，超声。得0.2μg/mL的对照品溶液。

2.3 精密度实验[5]取1mL对照品溶液，用流动相稀释成5mL，超声，得浓度为0.02μg/mL的溶液。在2.1中条件下测定，检查仪器的精密度。结果见表1。

表1 仪器精密度实验Table1 Precision experiment

2.4 标准曲线绘制 分别精密移取对照品溶液1、2、3、4mL,分别置于5mL棕色容量瓶中以流动相稀释，超声，冷却至室温，定容。由面积和浓度进行线性回归，得回归方程为 Y=7.421560×106X-2134.2（0-0.1μg ·mL-1）（R2=0.9999,n=3），在2.1中条件下测定。结果见表2。

表2 浓度与面积关系Table2 Relationship of concentration and peak area

2.5 样品溶液的制备 精密称取样品5g，置于100mL具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液，高压灭菌后，调pH至6.3左右，加入2mL混合酶溶液，摇匀后，过夜酶解。定容100mL容量瓶，先用部分流动相溶解，超声10min，冷却至室温，以流动相定容，取上清液过滤膜作为待测液。

2.6 加样回收率 取维生素B2标准品0.001g，入0.60，1.30，1.90mg，按照2.5项下的方法配制。在2.1中条件下测定。结果见表3。

表3 加样回收率实验结果 （n=6）Table3 Results of recovery ratio

2.7 稳定性实验 取浓度为0.02mg/mL的对照品溶液，放置于室温阴暗处1、2、4、8、12h，在2.1中条件下测定。结果表明样品在12h内稳定。见表4。

2.8 样品含量测定 取样品，在2.1中条件下测定。按照回归的方程计算标准的峰面积As，用测定的峰面积Ai与标准峰面积As的比值，进行木耳中维生素B2的含量计算。结果见表5。本实验维生素B2的HPLC色谱图见图1（A）（B）。

表4 稳定性实验Table4 Stability experiments

表5 维生素B2含量测定(n=6)Table5 The contents of vitamin b2 in samples

图1 维生素B2的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram

3 讨 论

本实验中需注意维生素B2损失的两个主要因素：（1）可被光破坏：一定波长的光波照射下发出荧光。在pH6～7的溶液中荧光最强，在其他条件恒定时，荧光强度F与维生素B2浓度C成正比；（2）在碱溶液中加热可被破坏，此外实验发现, 维生素B2具有较强的荧光，溶液酸度对维生素B2的荧光光谱有较大影响。溶剂极性对维生素B2的荧光影响较大，极性越小荧光越强。金属离子Fe3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Al3+等使荧光有不同程度的猝灭,其中Fe3+的猝灭作用最为明显[6]，故样品前处理尤为重要。本研究所采用FID-HPLC法具有简便、快捷及重复性好等优点，为测定木耳中维生素B2提供了可靠依据，值得应用推广。

[1]杨文斌.木耳的营养与生长发育条件[J].吉林蔬菜,2016(6):38.

[2]王荣艳,贾丽,钱春燕.HPLC-PDA法同时测定功能性饮料中9种水溶性维生素[J].现代科学仪器,2010,(4):98-101.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].二部.北京:化学工业出版社:2015232-1233.

[4]张晖,薛洪宝,马涛,等.毛细管电泳—激光诱导荧光法检测维生素B2的研究[J].营养学报,2017,39(1):92-95.

[5]陈光龙,李玉兰,刘敏,等.高效液相色谱法测定复合维生素B片中4种组分的含量[J]中国医院药学杂志,2006,26(10):1256-1258.

[6]范婷婷.维生素的荧光光谱及分析方法研究[D]河北师范大学,2010:9-28.