2016年海南省高毒力肺炎克雷伯菌的临床分布、毒力基因和分子流行病学特点

吴 华,周晓君,李天娇,黄东良

(海南省人民医院,海南 海口 570311)

·论著·

2016年海南省高毒力肺炎克雷伯菌的临床分布、毒力基因和分子流行病学特点

吴 华,周晓君,李天娇,黄东良

(海南省人民医院,海南 海口 570311)

目的分析2016年海南省某医院高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)的临床分布、荚膜分型、分子分型、毒力基因携带及药敏情况。方法回顾性分析2016年1—12月该院临床分离的肺炎克雷伯菌，通过黏液拉丝试验选取hvKP，对菌株进行药敏试验，与普通肺炎克雷伯菌(cKP)比较；采用聚合酶链反应(PCR)法对菌株进行荚膜分型、毒力基因和耐药基因检测，采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对菌株进行分子分型。结果共分离hvKP 84株，其中主要标本来源为痰(45株)；K1和K2是hvKP的主要荚膜型，ST23、ST65和ST86是hvKP的主要ST型；rmpA、aerobatin、allS、kfuBC和cf29a在hvKP中的携带率分别为90.48%、96.43%、42.86%、66.67%和53.57%，均高于cKP，PFGE发现allS基因仅存在于K1型；hvKP对抗菌药物的耐药率普遍低于cKP。结论痰是hvKP菌株，尤其是K1型hvKP的主要标本来源；超过90%的hvKP菌株携带rmpA和aerobatin基因，allS基因仅存在于K1型hvKP中。

肺炎克雷伯菌； 黏液表型； 毒力基因； 抗菌药物； 耐药性； 抗药性，微生物； 荚膜分型； 分子分型

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是一种常见的致病菌，广泛分布于世界各地。二十世纪八十年代以来，东南亚地区报道了一种可导致社区获得性感染，使患者发生原发性肝脓肿的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)，该菌除了引起肝脓肿，极易播散引起其他重要部位的转移性感染，预后较差。KP根据荚膜多糖抗原的结构可分为79个型别[1]，hvKP相关的型别主要有K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和KN1[2]。hvKP菌株在血琼脂平板上生长可表现出高黏液性，研究[3-4]发现，hvKP携带黏液表型调节基因(rmpA)和气杆菌素(aerobactin)，因此表现为高毒力。KP毒力相关的因素还包括菌毛、外膜蛋白、氮代谢等，对应的毒力基因为uge、mrkD、ureA、fimH、wabG等。血琼脂平板上不表现高黏液性的菌株通常被认为是普通肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)，hvKP和cKP在荚膜分型、分子分型、毒力基因携带和对抗菌药物的敏感性方面都存在差别。本文对某医院2016年分离的hvKP进行标本分布、荚膜分型、分子分型、毒力基因携带及药敏情况等方面分析，旨在为临床诊治hvKP引起的感染提供实验室支持依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2016年1—12月海南省人民医院就诊患者分离的KP。痰或伤口分泌物分离病原菌时，应符合痰、伤口分泌物标本原始涂片上皮细胞<10个/低倍视野；同一患者重复分离的菌株只留取患者首次分离的菌株。

1.2 菌株定义 通过黏液拉丝试验(string test，ST)对KP进行分类。用无菌接种环轻挑在血琼脂培养基上生长16～18 h的KP，如有黏液丝形成且长度≥5 mm即判为ST阳性；反之，黏液丝长度<5 mm或无黏液丝形成则为ST阴性。病例组为ST阳性菌株，即为hvKP；对照组为ST阴性菌株，即为cKP。

1.3 菌株鉴定及药敏分析 菌株鉴定采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统，根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)[5]标准进行药敏试验，检测菌株对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢西丁、头孢唑林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、环丙沙星的敏感性；药敏所用药物均购自英国OXOID公司。采用双纸片法进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检测，纸片购自中国食品药品鉴定研究院。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.4 荚膜分型与毒力基因检测 采用聚合酶链式反应(PCR)方法检测荚膜血清型K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和毒力基因rmpA、aerobactin、allS、mrkD、kfuBC、cf29a、fimH和wabG。引物合成和扩增条件参照文献[6]，引物由上海生工生物公司合成，扩增试剂购自日本Takara公司。

1.5 多位点序列分型(MLST)及耐药基因检测 采用PCR方法进行MLST和耐药基因KPC-2和NDM-1的检测。耐药基因引物合成参照文献[6] ，MLST的7个管家基因的引物序列参照MLST网站。PCR引物扩增后进行测序，测序结果提交至网站进行比对，分别得出每个位点的型别号，然后综合7个位点的型别号得出每株菌的ST型别(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)。

1.6 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 根据Han等[7]改良的方法对KP进行胶块制备、酶切及电泳，PFGE电泳DNA大小的标记菌为Braenderup血清型沙门菌H9812。采用BioNumerics软件对PFGE图像和MLST结果进行处理和分析。

1.7 统计分析 应用WHONET 5.6软件统计菌株对抗菌药物的敏感、中介及耐药率；应用SPSS19.0 统计软件对数据进行分析，两组率的比较使用卡方检验或Fisher精确概率检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株情况 2016年1—12月共分离KP 571株，其中hvKP菌株84株，占所有KP的14.71%。84株hvKP菌株标本来源为痰45株，脓肿穿刺液或脓性分泌物16株，血和尿各7株，腹腔积液和其他无菌体液各4株，胆汁1株。对照组为随机选取的72株cKP菌株，标本来源为痰23株，尿21株，伤口分泌物14株，胆汁5株，腹腔积液4株，血3株，脑脊液和关节液各1株。

2.2 菌株的荚膜分型及毒力基因携带情况 84株hvKP中K1型33株(39.29%)，其中有16株分离自痰标本；K2型18株(21.43%)，其中6株分离自痰标本，5株分离自脓肿或脓性分泌物；K20型7株(8.33%)，K5型和K54型各5株(各占5.95%)， K16、K57型各3株(各占3.57%)，另有10株ST阳性菌株不能被现有的引物所分型。hvKP和cKP 毒力基因的比较见表1。

2.3 MLST情况 84株hvKP中ST23型33株，ST86型11株，ST592型6株，ST65型5株，ST268、ST412和ST420型各3株，ST29型和ST1049型各2株，ST22、ST35、ST36、ST45、ST124、ST188、ST218、ST375、ST380、ST419、ST660、ST692、ST828、ST1764、ST1805、ST1853型各1株。K1型全部为ST23型， K2型中有11株为ST86型，5株为ST65型。见图1。

2.4 PFGE分型情况 84株hvKP中有1株菌的PFGE分不出条带，故只分析83株菌情况。荚膜型和ST型别一致者带型较为接近或相似，不同者则带型多样，另发现allS基因几乎全部为K1型。见图1。

表1hvKP和cKP毒力基因的比较

Table1Comparison of virulence genes between hvKP and cKP

基因hvKP(n=84)株数比率(%)cKP(n=72)株数比率(%)χ2PrmpA7690．4822．78119．270．000aerobactin8196．4334．17132．790．000allS3642．8656．9425．810．000kfuBC5666．671520．8332．840．000cf29a4553．5756．9438．70．000mrkD84100．0072100．00 - -fim84100．0072100．00 - -wabG84100．0072100．00 - -

2.5 菌株的药敏情况 hvKP对常用抗菌药物的敏感性均高于cKP，且ESBLs的产生率(8.33%)也低于cKP(43.06%)，未发现对碳青霉烯类药物耐药的hvKP，发现5株对碳青霉烯类药物不敏感的cKP，其中1株KPC-2阳性，1株NDM-1阳性。hvKP和cKP对抗菌药物的药敏情况比较见表2。

表2 hvKP和cKP对常用抗菌药物的药敏情况比较

*：指卡方值已校正

3 讨论

hvKP最初报道来自肝脓肿患者，因其感染社区来源的无基础疾病患者，而且感染菌株可由原发部位转移播散至其他部位，故称为hvKP。进一步研究发现，hvKP感染的患者可以单纯表现为肺、脑和前列腺脓肿[8]，侵袭性感染的原发部位已不仅局限于肝脏，还可以侵犯多个部位。KP是引起呼吸道感染的主要病原菌[9]，本研究发现hvKP中，53.57%来自痰标本。鉴于肺泡的解剖结构，肺部感染的细菌可能容易进入血流，然后随血流到达其他部位引起的转移性感染，所以hvKP肺部感染应引起临床医生的重视。

目前，hvKP在国际上尚无统一的定义标准，但是研究发现菌落的高黏液表型与菌株高毒力密切相关，菌落的高黏液表型是细菌耐受细胞吞噬作用和细胞杀伤作用的物质基础[10]。高黏液表型可通过ST试验来判断，故一般研究都将ST试验作为hvKP的筛选试验。另外，虽然高黏液的菌落肉眼看起来是黏稠的，但菌株的高黏液表型不能依据肉眼观察黏液性状来判断，而必须根据ST试验结果来判断[11]。ST试验操作简单，不需要特殊的仪器设备，容易被临床微生物工作者所接受。目前的研究结果尚未证实是否所有hvKP菌株都具有高黏性特征[2]，因而根据黏液表型可能会出现hvKP漏检。荚膜被认为是KP最重要的毒力决定因素。台湾的一项研究[12]发现，K1型是导致KP菌血症最常见的血清型，K2型是呼吸道标本中最常见的血清型。但本研究发现，痰标本中hvKP最多的荚膜型别为K1型，可能存在地区差异。

注：K-type指荚膜分型，ST type指序列分型，S-type指标本类型( sp：痰，se：分泌物，ps：脓液，bl：血，cv：无菌中段尿；bi：胆汁，ab：腹腔积液；sf：脑脊液，pus：脓性分泌物，pu：引流液)

图183株hvKP的PFGE聚类分析图

Figure1Dendrogram based on PFGE of 83 hvKP strains

研究[3-4,11]发现，黏液表型调节基因(rmpA)和气杆菌素(aerobactin)多存在于hvKP，说明以上两种因素可增强KP的毒力。本研究中hvKP菌株rmpA和aerobactin阳性率均超过90%，而在cKP菌株中的阳性率则低于5%，因此，我们认为此两种基因可用来鉴别hvKP和cKP。本组研究结果显示，cf29a、allS和kfuBC 3个基因的阳性率，在hvKP中为42.86%～66.67%，在cKP中为6.94～20.83%，因此，不能用这三个基因区分hvKP和cKP。cf29a基因可以表达黏附素cf29k，研究表明，cf29a基因的检出率与hvKP明显相关[13]；allS基因可编码尿囊素调节因子的活性剂，使hvKP在需氧和厌氧的条件下以尿囊作为碳源、氮源及能量源[13]；kfuBC基因表达产物参与铁摄取系统，能通过螯合作用介导细菌吸收仅在人体肠道中才有的游离三价铁，故可增强hvKP在肠道中的定植，kfuBC还与hvKP脓肿性眼内炎高度相关[13]。本研究发现wabG、fimH和mrkD 3个基因在hvKP和cKP组之间差异无统计学意义。既往研究[14-16]发现，wabG可使KP耐受吞噬作用而促进感染，I型菌毛的尖端黏附素fimH基因是KP泌尿道感染的重要毒力因素，mrkD基因可通过III型菌毛促进生物膜的形成。

近年来，KP对碳青霉烯类药物的耐药率有升高的趋势，与大多数文献报道[17-18]一致。本研究中hvKP对抗菌药物的耐药率，以及ESBLs的产生率均低于cKP，可能与地区差异有关。可接合质粒造成的耐药基因快速水平转移对KP耐碳青霉烯类药物起着重要的作用[19]；如Siu等[20]发现的1株K2型高毒力的菌株通过质粒接受KPC-2基因而出现对碳青霉烯类药物耐药；Wei等[21]报道了ST23型hvKP从ST11型菌株获得KPC-2基因的现象；KPC-2基因可以从cKP传播给hvKP[6]。本研究发现了携带KPC-2基因的cKP菌株，因此，KPC-2基因可能传播给hvKP，使其对碳青霉烯类药物产生耐药，医院感染控制专职人员及临床医生应加强对KP感染的重视。

目前，分子分型技术已广泛应用于细菌的溯源分析。由于PFGE分型技术分辨力高，被认为是暴发感染溯源中细菌分型的“金标准”。MLST技术由于操作简单、可重复性好、已经实现全球数据比对和综合分析等优势，也成为临床微生物科研常用的一种分型技术。本研究中同源性的菌株未发现标本类型的聚集，说明本研究菌株无明显暴发。本研究显示，allS基因几乎只存在于K1型的hvKP，推测allS基因是K1型hvKP所特有的基因，可用来鉴定K1型hvKP。MLST分析发现，K1荚膜型菌株基本都是ST23型；而K2型菌株主要为ST86型和ST65型，但仍存在ST375和ST380型，存在多样性，与台湾的研究[22]结果基本一致。

总之，通过对医院一年期间分离的KP进行研究，发现痰为hvKP的主要标本来源，临床医生应注意呼吸道标本中分离hvKP的意义。K1和K2型是hvKP最主要的荚膜型别，ST23、ST65和ST86是hvKP主要的ST型别。毒力基因aearobatin、allS、rmpA、kfuBC和cf29a在hvKP中的携带率均高于cKP，allS基因可以用于K1型hvKP的鉴定。尽管hvKP对抗菌药物的耐药率均低于cKP，耐药性可以通过KPC-2基因进行传播，应警惕获得性耐药的可能。

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Clinicaldistribution,virulencefactors,andmolecularepidemiologyofhypervirulentKlebsiellapneumoniaeinHainanProvincein2016

WUHua,ZHOUXiao-jun,LITian-jiao,HUANGDong-liang

(HainanGeneralHospital,Haikou570311,China)

ObjectiveTo investigate clinical distribution, capsular serotyping, molecular typing, virulence gene carriage, and antimicrobial susceptibility of hypervirulentKlebsiellapneumoniae(hvKP) strains isolated from a hospital in Hainan Province in 2016.MethodsKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) isolated from the hospital between January and December 2016 were analyzed retrospectively, hvKP strains were selected through string test, antimicrobial susceptibility testing was performed and compared with classicK.pneumoniae(cKP); capsular serotyping, virulence genes, and drug resistance genes of hvKP strains were detected with polymerase chain reaction, molecular typing was performed with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing.ResultsA total of 84 hvKP strains were isolated, the main specimen source was sputum(45 strains); K1 and K2 were the major capsular serotypes of hvKP, while ST23, ST65, and ST86 were the main sequence types of hvKP. The carriage rates ofrmpA,aerobatin,allS,kfuBC, andcf29ain hvKP were 90.48%, 96.43%, 42.86%, 66.67%, and 53.57% respectively, all of them were statistically higher than those of cKP strains, PFGE found thatallS was positive only among K1 strains; most antimicrobial resistance rates of hvKP were lower than those of the cKP.ConclusionSputum is the main specimen source of hvKP, especially K1 serotype; more than 90% of hvKP strains carryrmpA andaerobatingenes,allS gene only exists in K1 type hvKP.

Klebsiellapneumoniae; mucoid phenotype; virulent gene; antimicrobial agent; drug resistance; microbial; capsular serotyping; molecular typing

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：10-15]

2017-04-16

海南省自然科学基金(20158266)

吴华(1980-)，女(汉族)，河南省开封市人，副主任技师，主要从事临床微生物研究。

吴华 E-mail：syjykwuhua@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.003

R181.3+2

A

1671-9638(2018)01-0010-06

孟秀娟、左双燕)