挤压膨化对白汤酱油成曲糖化酶活力的影响

孙言，焦爱权，李燕，徐学明，金征宇*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)

挤压膨化对白汤酱油成曲糖化酶活力的影响

孙言1,2，焦爱权1,2，李燕1,2，徐学明1，金征宇1,2*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)

以面粉为原料进行挤压膨化，以成曲糖化酶活力为评价指标，研究挤压膨化参数对白汤酱油成曲糖化酶活力的影响。通过单因素试验分别研究了面粉含水率、螺杆转速、喂料速度和套筒温度对糖化酶活力的影响。在单因素的基础上进行响应面试验，对挤压膨化参数进行优化。结果表明，最佳的挤压膨化参数为面粉含水率45%，螺杆转速100 r/min，喂料速度10 kg/h，套筒温度80 ℃，在此条件下，糖化酶活力为1 293.49 U/g。利用高糖化酶活力的成曲，采用低盐固态发酵方式进行白汤酱油酿造，测得白汤酱油的氨基酸态氮含量为0.65 g/dL，还原糖含量为243.25 mg/mL，酱油口味清甜，酱香浓郁。

挤压膨化；白汤酱油；糖化酶；制曲

白汤酱油是江苏苏北地区特色的调味品，是一种以面粉为原料，蒸煮熟化后，经微生物发酵生成的一种口味清甜，醇厚柔和，酱香、酯香味突出，澄清有光泽的淡色酱油[1]。

酱油酿造是制曲中微生物产生的多种酶与熟化的原料发生复杂生化反应的结果，在这个反应中，主要是蛋白质和淀粉的水解[2-3]。该水解反应的程度，将影响到原料利用率及产品的风味与口感[4]。因此，制曲是酱油酿造中的重要一环，提高成曲酶活力是提高酱油品质的一条重要途径[5]。而制曲的实质是给曲霉提供最适生长环境，促使微生物分泌并积累大量的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等酶系。这些酶中，糖化酶可作为衡量白汤酱油成曲质量的标准之一。这是因为糖化酶的糖化作用产生的单糖除了葡萄糖之外，还会生成一些果糖与五碳糖。这些对于酱油色泽的形成与发酵至关重要，若糖化作用完全，则白汤酱油甜味醇厚，体态浓厚，固形物含量高，可明显提高酱油品质[6-7]。

酱油酿造每一个工艺环节都是紧密相连，原料处理是为了在制曲过程中原料可被微生物更好的生长利用，以获得更高的酶活力，进而使发酵高效的进行，因此原料处理效果与成曲酶活力关系密切。而利用挤压膨化技术对原料处理时，挤压膨化条件决定了原料处理效果，但挤压膨化条件与成曲酶活力之间的关系却少见研究报道。

本项目为提高白汤酱油成曲糖化酶活力，探讨挤压膨化条件与制曲酶活力之间的关系，从面粉含水率、螺杆转速、喂料速度和套筒温度4个参数出发，以面粉为原料进行挤压膨化，以糖化酶活力为指标，采用单因素和响应面优化试验探讨了不同挤压膨化参数对糖化酶活力的影响，同时以高酶活力成曲进行低盐固态发酵，为挤压膨化技术应用于酱油生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面粉：江苏苏美集团提供；酱油曲精：上海迪发酿造生物制品有限公司；冰乙酸、乙酸钠、Na2S2O3、Na2CO3、重铬酸钾、I2、KI、浓H2SO4、NaOH、可溶性淀粉(以上均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FMHE36-24型双螺杆挤压机，湖南富马科食品工程技术有限公司，螺杆直径24 mm，长径比24∶1；AL104型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；RQH-150型恒温恒湿培养箱，郑州生元仪器有限公司；HWS24型电热恒温水浴，上海一恒科技有限公司；电热恒温鼓风干燥箱、DELTA320型pH计，上海分析仪器三厂；Eppendorf-5804R型冷冻离心机，德国艾本德有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 操作要点

1.3.1.1 成曲制备

面粉经过双螺杆挤压机处理后得到挤压膨化物，待挤压膨化物自然冷却至室温后，接入酱油曲精与面粉的混合物，曲精的用量为0.05%。然后均匀地平铺在各个曲盘中，放入恒温恒湿培养箱中培养，温度控制在30～34 ℃，培养45 h之后结束制曲。

1.3.1.2 低盐固态发酵

将成曲装入1 000 mL的小型发酵罐内，控制酱醅水分约为55%，加入13°Bé 55-65 ℃的热盐水，待盐水渗入成曲内后将成曲压实。发酵罐用封口膜封口，置于45 ℃恒温培养箱内，发酵30 d后过滤得到白汤酱油。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 粗酶液的提取

称取5 g成曲(按干基重量计算)，将成曲捣碎后用60 mL蒸馏水溶解，然后用糖化酶测定所需的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100 mL，放入40 ℃的水浴锅内浸提1 h，期间每隔10 min搅拌1次。浸提之后3 000 r/min离心15 min，取其上清液待测[8]。

1.3.2.2 糖化酶活力测定

参考国标GB 8276—2006测定。

1.3.2.3 挤压膨化物与传统蒸煮物的微观结构分析

使用扫描电子显微镜(transmission electron microscope，SEM)对挤压膨化物和传统蒸煮物的微观结构进行直观分析，样品使用戊二醛进行固定，然后用磷酸缓冲液漂洗，之后用锇酸固定并再次漂洗，干燥后用离子溅射法镀膜，最后置于扫描电镜内观察。

1.3.3 单因素试验

选取4个因素进行单因素试验，其中面粉含水率水平分别为25%、30%、35%、40%、45%，螺杆转速分别为100、120、140、160、180 r/min，喂料速度分别为8、10、12、14、16 kg/h，套筒温度分别为80、100、120、140、160 ℃。以糖化酶活力为指标，考察各因素对糖化酶活力的影响，确定其最佳因素水平。单因素试验采用渐变式优化法，研究第1个因素面粉含水率时，其他因素水平固定为：螺杆转速140 r/min，喂料速度12 kg/h，套筒温度120 ℃。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上确定4个因素的3个水平，以糖化酶活力为评价指标，根据Box-Benhnken中心组合设计原理设计试验优化挤压膨化参数，因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken 中心组合设计的因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

2 结果与分析

2.1 挤压膨化物与传统蒸煮物的微观结构分析结果

图1是面粉经过挤压膨化和传统蒸煮处理的扫描电镜图像，其中A图是挤压膨化处理后的图像，B图是传统蒸煮处理后的图像。两种处理方式都使面粉里面的淀粉或其他组分发生了不同程度的破碎和降解。但蒸煮主要是热作用，其大分子降解程度较低，从B图中可明显看到未被降解的淀粉颗粒，其结构质密，较为光滑。而挤压膨化由于其高温、高剪切力作用，大分子降解程度高，淀粉颗粒结构被破坏程度大，且物料从模头挤出时，水蒸气急剧汽化，从而形成了A图中结构疏松，表面粗糙，不规则的微孔隙结构。这样就利于微生物的附着和对原料的充分利用。

图1 面粉挤压膨化与蒸煮处理的SEM图像Fig.1 SEM images of wheat flour treated by extrusion and traditional steam cooking

2.2 单因素试验结果

2.2.1 面粉含水率对糖化酶活力的影响

由图2可知，随着面粉含水率的增加，糖化酶活力逐渐增大。当面粉含水率在25%时，糖化酶活力为435.24 U/g，糖化酶活力处于较低水平。这主要是因为面粉含水率较低时，在经过挤压处理后，曲料里面的水分少，不利于营养物质通过自由水扩散到基质表面，微生物的生长受到抑制，从而限制了糖化酶活力的提高[9]。当面粉含水率从25%增加到40%时，糖化酶活力增长速度明显加快，而从40%增加到45%时，糖化酶活力增长速度趋于平缓。这主要是水分含量过高，曲料易结块，挤压膨化形成的多孔状的结构被破坏，空气通透性变差，抑制了菌体的生长，影响菌体糖化酶的分泌，同时也易滋生腐败菌，严重时会出现“酸曲”的现象，所以水分含量不宜从45%继续升高。因此，面粉含水率可初步确定为45%。

图2 面粉含水率对糖化酶活力的影响Fig.2 The effect of the moisture content of flour on glucoamylase activity

2.2.2 螺杆转速对糖化酶活力的影响

由图3可知，糖化酶活力都随着螺杆转速的提高而降低。糖化酶活力在螺杆转速为100 r/min时最高，最高为952.23 U/g，之后随着螺杆转速提高而下降。当转速超过140 r/min，酶活力下降的速度增快，转速达到160 r/min后，酶活力不再变化。螺杆转速提高，糖化酶活力降低，这主要是因为当喂料速度一定时，螺杆转速提高，物料在挤压膨化机套筒内停留的时间缩短，不利于淀粉分子的降解[10]，同时蛋白质在高水分、高转速的情况下，变性程度降低[11]，影响微生物对曲料中营养物质的利用。在挤压机正常运行时，喂料速度与螺杆速度是相协调的，套筒内既不过载也不可断料，喂料速度固定后，若螺杆速度从100 r/min继续降低就容易出现过载导致挤压机堵塞。因此，螺杆转速可初步确定为100 r/min。

图3 螺杆转速对糖化酶活力的影响Fig.3 The effect of screw speed on glucoamylase activity

2.2.3 喂料速度对糖化酶活力的影响

由图4可知，糖化酶活力随着喂料速度的增加呈现出先升高后降低的趋势，在喂料速度从8 kg/h增大至12 kg/h时，糖化酶活力变化幅度较小，10 kg/h时糖化酶活力最大为955.33 U/g。随着喂料速度继续增大至16 kg/h，糖化酶活力从952.23 U/g降低至689.95 U/g，降低了27.5%。在喂料速度超过某一范围时，糖化酶活力明显降低的主要原因是喂料速度和螺杆转速共同决定了机筒填充程度[12]，在螺杆转速一定时，喂料速度增加，引起机筒填充度增加，挤压机扭矩逐渐增大，机筒内压力增大，剪切作用力增强，对物料做功增加[13]。物料里面的淀粉过度糊化，蛋白质过度变性，不利于菌体对营养物质的利用。因此，喂料速度可初步确定为10 kg/h。

图4 喂料速度对糖化酶活力的影响Fig.4 The effect of feeding speed on glucoamylase activity

2.2.4 套筒温度对糖化酶活力的影响

由图5可知，糖化酶活力随着套筒温度的升高而呈降低的趋势，在80 ℃时酶活力最高，糖化酶活力最高为1285.39 U/g，在160 ℃时，糖化酶活力达到最低，最低为579.90 U/g。套筒温度升高，糖化酶活力降低，这主要是因为物料在低含水率，螺杆转速小于140 r/min，膨化温度80 ℃左右时，小麦面粉就会急剧糊化，当水分含量提高时，小麦面粉的糊化度将进一步提高[10]。所以在面粉含水率为45%，套筒温度80 ℃时，面粉已经糊化，面粉中的蛋白质适度变性，这样有利于微生物对曲料的利用，菌体生长良好。而随着套筒温度进一步的提高，蛋白质过度变性，水溶性降低，同时使原料焦糊，原料不易被菌体分泌的酶分解利用。过高的温度也使水分在挤压膨化处理过程中损失较多，造成曲料太干，微生物难以利用，从而造成糖化酶活力降低。若温度降低至80 ℃以下，面粉中的淀粉不能达到适度的糊化度，没法使菌体更好的利用。因此，套筒温度可初步确定为80 ℃。

图5 套筒温度对糖化酶活力的影响Fig.5 The effect of barrel temperature on glucoamylase activity

2.3 响应面优化试验结果与分析

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选择面粉含水率(A)、螺杆转速(B)、喂料速度(C)和套筒温度(D)进行4因素3水平响应面分析试验，共设计了29个试验点，实验设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken 中心组合实验设计与结果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken central composite

2.3.1 拟合模型的建立及显著性检验

采用Design-Expert.8.05b软件对表2中的数据进行二次多项式回归拟合，得到糖化酶活力对面粉含水率(A)、螺杆转速(B)、喂料速度(C)和套筒温度(D)的二次多项回归方程：Y=1 277.052+21.305A-82.715 8B+90.324 17C+83.223 33D-54.462 5AC+56.957 5BD+61.03CD-112.97A2-94.138 5B2-110.996C2-142.237D2，进一步对回归方程进行分析，其回归系数显著性分析结果见表3。

由表3可知，通过响应面优化后得到的模型F值为17.69，p<0.0001，表明回归模型达到了极显著水平，说明该模型可信。失拟项p=0.0996>0.05，表明失拟不显著，模型的复相关系数R2=91.97%，说明该模型可以解释91.97%响应值的变化，因而该回归方程拟合程度良好，用此模型可对糖化酶活力进行分析和预测。优化的4个因素中B、C、D对糖化酶活力有极显著的影响(p<0.01)，交互项AC、CD、BD对糖化酶活力影响显著(p<0.05)，而二次项A2、B2、C2、D2影响水平达到极显著(p<0.01)。通过F值大小可知，在试验范围内各个因素对糖化酶活力影响的大小顺序为喂料速度(C)>螺杆转速(B)>套筒温度(D)>面粉含水率(A)。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance on regression model

注：“**”表示影响极显著(p<0.01)；“*”表示影响显著(p<0.05)。

2.3.2 响应面分析

从图6～图8可直观地反映出各个因素相互作用对响应值的影响，响应面图的三维曲面坡度，表明了响应值的大小受到试验因子的影响程度，坡度越陡峭，影响程度越大[14]。比较3组图，喂料速度(C)对糖化酶活力影响最为显著，其曲线比较陡峭，而螺杆转速、套筒温度、面粉含水率次之，其曲线比较平滑。从3组等高线图可知，面粉含水率(A)和喂料速度(C)、螺杆转速(B)和套筒温度(D)、喂料速度(C)和套筒温度(D)等高线图呈现出明显的椭圆形，表明两因素间交互作用比较显著。

2.2.3 验证试验

通过Design-Expert.8.05b软件优化得到，获得最大糖化酶活力时的挤压膨化参数为面粉含水率44.94%、螺杆转速96.25 r/min、喂料速度10.47 kg/h、套筒温度82.13 ℃，在此挤压条件下糖化酶活力预测值为1319.25 U/g。为了方便验证试验，采用面粉含水率45%、螺杆转速100 r/min、喂料速度10 kg/h、套筒温度80 ℃进行3次试验，并以传统蒸煮法处理面粉制曲后测成曲糖化酶活力作为对照。试验结果如表4。试验得到的糖化酶活力在1293.49 U/g左右，与预测值的误差为1.95%，表明优化结果可信。而采用传统蒸煮处理面粉后制曲，成曲糖化酶活力为724.88 U/g，与对照相比，试验组糖化酶活力提高了78.44%。

图6 喂料速度与面粉含水率对糖化酶活力影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of feeding spend and the moisture content of flour on glucoamylase activity

图7 套筒温度与螺杆转速对糖化酶活力影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of barrel temperature and screw speed on glucoamylase activity

图8 套筒温度与喂料速度对糖化酶活力影响的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of barrel temperature and feeding spend on glucoamylase activity

2.2.4 白汤酱油酿造试验

以优化后高糖化酶活力的成曲进行低盐固态发酵，发酵30 d后过滤得到白汤酱油，测定其各项理化指标，结果见表5。白汤酱油口味清甜、色泽以鲜亮的淡红色为主，带有光泽，酱香浓郁，无不良气味。

表4 验证试验结果Table 4 The result of verification test

表5 白汤酱油的理化指标Table 5 Physiochemical indexes of white soy sauce

3 结论

本实验以提高糖化酶活力为目的，探讨了挤压膨化条件与制曲酶活力之间的关系。以面粉为原料进行挤压膨化，通过单因素以及响应面优化试验，得到最佳的挤压膨化参数为面粉含水率45%，螺杆转速100 r/min，喂料速度10 kg/h，套筒温度80 ℃，在此条件下，糖化酶活力为1 293.49 U/g。利用高糖化酶活力的成曲，采用低盐固态发酵方式进行白汤酱油酿造，测得白汤酱油的氨基酸态氮含量为0.65 g/100 mL，还原糖含量为243.25 mg/mL酱香浓郁。本试验也为挤压膨化技术应用在酱油酿造工业中提供一定的参考与指导。

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Effectofextrusionontheglucoamylaseactivityofkojiforwhitesoysauce

SUN Yan1,2,JIAO Ai-quan1,2,LI Yan1,2,XU Xue-ming1,JIN Zheng-yu1,2*

1(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)2(State key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Wheat flour was extruded to prepare koji of white soy sauce.The glucoamylase activity of koji is regarded as the index.The effects of different extrusion parameters on the glacoamylase activity of koji were studied.By single factor experiment,the effect of the moisture content of flour,screw speed,feeding speed and barrel temperature on the glucoamylase activity were investigated.Then the extrusion parameters were optimized by Response Surface Methodology (RSM).The results showed that the optimal glucoamylase activity was 1 293.49 U/g under the following extrusion conditions,including moisture content of 40%,screw speed of 100 r/min,feeding speed of 10 kg/h,and barrel temperature of 80 ℃.The koji with higher glucoamylase activity was utilized to ferment and the brewing experiment of white soy sauce was conducted by low-salt solid-state fermentation.At the end of fermentation,the contents of amino acid nitrogen and reducing sugar in the white soy sauce were 0.65 g/100mL and 243.25 mg/mL,respectively.The white soy sauce had sweet taste and good flavor.

extrusion;white soy sauce;glucoamylase;koji-making

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014673

硕士研究生(金征宇教授为通讯作者，E-mail：jinlab2008@yahoo.com)。

国家科技支撑计划项目子课题(2016YFD0400304)

2017-05-02，改回日期：2017-07-19