双甘膦降解菌的筛选与降解性能

封雍婕 郑鑫 杨福民 杜丽琨 邱雪琳 秦玥 夏烈文

摘 要：利用预先堆肥的方式富集耐受双甘膦微生物，进而筛选出能降解双甘膦的细菌并研究其降解效果，为处理含双甘膦废弃物提供依据。结果表明，筛选得到的微生物具有降解双甘膦能力，降解产物主要为无机磷酸盐。

关键词：双甘膦； 降膦菌；磷酸盐

1引言：

双甘膦是广泛使用的草甘膦除草剂IDA法生产过程中的中间体。双甘膦生产过程中产生的含双甘膦废弃物是草甘膦行业环保问题的重要关注内容，目前主要采用物化方法进行处理。物化方法往往工艺条件苛刻、成要高昂、容易产生二次污染。微生物方法是废水处理的常用手段，具有条件温和、成要低廉的优势。研究微生物降解双甘膦性能，对探索生化法处理双甘膦废水可能性具有重要意义。

2实验部分：

2.1材料

双甘膦（含量≥98%）取自草甘膦企业生产车间，菌种来源为城市下水道泥与景观阔叶林落叶、果皮、双甘膦混合物长期培养所得土样。

培养基的配制。

基础盐培养基：称取2.00g （NH4）2SO4、0.20g MgSO4·7H2O、0.60g NaH2PO4·2H2O、0.65g K2HPO4·3H2O、0.64g CaCl2、3.00g双甘膦加水搅拌溶解，调节pH 7。121℃灭菌20分钟后备用。得到含磷源基础盐培养基，同样方法，但以NaCl和KCl代替NaH2PO4·2H2O和g K2HPO4·3H2O，得到不含磷源基础盐培养基。

平板固体培养基：

基础盐平板固体培养基：按含磷基础盐培养基比例加入无机盐和水，溶解扣按2%wt加入琼脂粉，加热搅拌使其溶解，定容至1000mL。

牛肉膏蛋白胨培养基：称取3g牛肉膏、10g蛋白胨、15gNaCl、20g琼脂粉加水搅拌溶解，调节pH 7，定容至1000mL。

培养基在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20分钟，冷却至50℃左右，無菌条件下倒入培养皿中，完全凝固并冷却后分别得到基础盐平板固体培养基和牛肉蛋白胨平板固体培养基。

2.2实验方法

微生物的采集、富集培养与驯化。

称取10g土样，加50mL水搅拌均匀，放置几小时后取上清液用无菌水稀释后作为原始菌种。用移液枪移取稀释度10-1～10-5的菌液0.2mL至基础盐平板固体培养基上并涂布均匀，倒置，35℃恒温培养72h。

无菌条件下，用接种环从上述平板培养基中挑取一个单菌落利用平板划线法接种于同种基础盐平板固体培养基，恒温培养对菌落进行一次纯化。反复纯化两次，得到一株生长形态均匀的菌株R，并用基础盐平板固体培养基斜面划线保存备用。挑取单个菌落并用平板划线法接种于牛肉膏蛋白胨平板固体培养基中进行扩增。

降解菌对双甘膦的降解性能测定。

3结果与讨论

3.1双甘膦降解菌的生长状况

土样中部分微生物具有双甘膦耐受性。微生物筛选过程中在平板固体培养基上的生长状况如图1所示。菌株为灰白色、菌落较小、干燥、呈扁平状、边缘不整齐圆形等。筛选过程中发现，稀释梯度为10-3的原始菌种在基础盐平板固体培养基中长出的微生物适合微生物筛选。

3.2 培养液中双甘膦的变化

筛选得到的菌种在含3g/L双甘膦的基础盐培养基中对双甘膦的降解情况如图2所示。在最初三天内双甘膦降解很快，三天过后双甘膦降解率缓慢增加。这是因为培养前3d该菌种R生长情况达到对数生长期，在该段时间内菌种R对碳源需求较大，使双甘膦的降解效率达到了近30%。随着时间的延长，菌株R处于稳定期并逐渐衰亡，故第3～9d降解率增长较慢。培养九天后液体培养基变得浑浊，双甘膦不再降解，微生物基本死亡。

通过对含无机磷源和不含无机磷源的培养液的测定，发现该菌株对含有无机磷源的培养液中双甘膦的降解效果更好，但二者的降解效果相差不大，即该菌种R生长过程中对无机磷源的需求不高，但少量的无机磷源有助于菌种在培养最初阶段的生长。

3.3培养液中总磷变化

筛选得到的双甘膦降解菌在3g/L的无机盐培养基中培养，总磷的变化见表1。在双甘膦降解菌培养过程中，总磷浓度先减小，然后增加，但变化幅度不大。

3.4培养液中无机磷的变化

3g/L的双甘膦培养基中无机磷的变化见表2。含磷源培养液中无机磷含量随降膦菌培养时间增加而增加，不含磷源的培养液中无机磷含量在前6d检测不出，在第9d时检测出有无机磷。两种培养液中双甘膦降解菌均能将双甘膦降解为无机磷，但含磷源培养液中双甘膦转化为无机磷的量更大，说明培养初期降解菌所需要的磷营养由培养液中磷酸盐提供更有利于双甘膦降解菌生长，不含磷源的培养液中双甘膦降解菌在最初6天中生长缓慢，检测不出降解产物无机磷。

4结论

采用双甘膦为唯一磷源的平板固体培养基筛选方法，分离、纯化得到的具有双甘膦降解性能的菌株R。菌株在双甘膦为唯一碳源和唯一磷源/唯一磷源的基础盐培养基中均能对双甘膦进行降解，并部分转化为无机磷。但是在实验培养期内，双甘膦降解率较低，且大部分双甘膦未被降解或者没有完全直接降解成无机磷而是被转化成其他形态的有机磷。

参考文献：

[1] 周海云，刘树洋，徐宁，姜伟立，公彦猛，黄瑞琦. 双甘膦废水的湿式氧化处理。农药.2017， 17，56（1）： 23-27

[2]金潇，颜冬云，秦文秀。有机磷农药的微生物降解技术.湖南农业科学，2011（09）： 93-97

[3] 全鑫， 周春雨， 范婕妤， 等. 草甘膦高效降解菌的筛选鉴定及降解特性研究[J]. 四川大学学报（自然科学版）， 2010， 47（4）： 921-925.