基于线粒体COI基因序列的南四湖外来须鳗虾虎鱼的种类鉴定

王亚楠，李秀启，客涵，丛旭日，师吉华

（山东省淡水渔业研究院，山东省淡水水产遗传育种重点实验室，山东 济南 250013）

基于线粒体COI基因序列的南四湖外来须鳗虾虎鱼的种类鉴定

王亚楠，李秀启，客涵，丛旭日，师吉华

（山东省淡水渔业研究院，山东省淡水水产遗传育种重点实验室，山东 济南 250013）

在形态学鉴定的基础上，采用线粒体COI基因特异扩增测序及GenBank虾虎鱼亚科相近属已有序列联合配对分析的方法鉴定了南四湖须鳗虾虎鱼Taenioides cirratus的分类地位，探讨了该鱼的种群来源。对16尾须鳗虾虎鱼的线粒体COI基因进行测序，获得了长度为633 bp的COI基因序列，从Genbank中获得其他17种虾虎鱼的相应序列。结果显示：须鳗虾虎鱼COI基因部分序列密码子的第一位点GC含量最高，平均A+T含量高于G+C含量。用MEGA软件计算虾虎鱼的种间遗传距离，用邻接法和最大似然法构建分子系统树结果表明，南四湖须鳗虾虎鱼与采自福建兴化湾的须鳗虾虎鱼亲缘关系最近，可归为鳗虾虎鱼属，但在遗传变异上已超出种的分化水平。推测南四湖的须鳗虾虎鱼由长江和淮河水系调水进入的须鳗虾虎鱼个体扩散建群，可能受南水北调东线工程的调水迁移的影响。

须鳗虾虎鱼；COI基因；种类鉴定；南四湖

南四湖（34°26′～35°20′N，116°34′～117°21′E）属淮河流域泗河水系，自北向南由南阳、独山、昭阳和微山4个相连的湖区组成，属河迹洼地浅水型湖泊，水域面积约1 266km2，担负着蓄水、渔业、防洪、灌溉、排涝、航运等功能[1]。根据中国淡水鱼类分布区划[2],南四湖鱼类区划属于江河平原区的河海亚区，鱼类区系组成以我国特有的江河平原复合体鱼类为主。受黄河泛滥改道、京杭大运河航运以及南水北调东线工程的影响，黄河、淮河、长江和钱塘江水系相互贯通，使得区域间的物种迁移更为频繁。

须鳗虾虎鱼Taenioides cirratus隶属于虾虎鱼亚目Gobioidei虾虎鱼科Gobiidae，近盲虾虎鱼亚科Amblyopinae鳗虾虎鱼属Taenioides Lacepède，为暖水性近岸底层小型鱼类，栖息于河口半咸淡水水域，也进入江河下游水体，摄食小型鱼类、幼虾、桡足类及其他底栖无脊椎动物等，少数为经济鱼类，大部分为大型鱼类饵料，在水生种质资源中具有重要地位[3]。我国内陆水体太湖、洪泽湖等淡水中有其分布，但渤海区没有分布[4-6]。近年，长江中下游地区一些湖泊如江苏的高邮湖、淀山湖和安徽巢湖均有须鳗虾虎鱼的报道，种群数量有增加的趋势。2011年以来，在山东南四湖的下级湖地笼渔获物中也时常出现，但南四湖仅记录吻虾虎鱼属Rhinogobius leadvolli一种[7]，20世纪80年代的渔业资源调查也未采集到须鳗虾虎鱼。因此，识别进入南四湖并形成种群的虾虎鱼属种地位和扩散途径、分布范围及资源状况，分析虾虎鱼对湖区其他水生生物和渔业资源的影响等基础性研究急待开展。

虾虎鱼种类繁多，个体较小，生活环境多样，物种多样性较高，一直是传统形态分类比较困难的类群，其种类命名及系统分类关系争议较大。近年来，物种分类已广泛采用基因序列辅助，分子数据与传统形态分类的结合较好地解决了近缘物种难以界定的问题[8]。线粒体DNA的COI基因（细胞色素氧化酶亚基Ⅰ）靠近5′端的一段序列长度适宜，富含系统发育信号，操作快速简便，具有较高的物种鉴定可靠性[9,10]，已被广泛应用于鱼类鉴定、分类和系统演化等研究。于亚男等[11]扩增了采自长江口的7种虾虎鱼19个个体的线粒体COI基因，证实了COI基因作为虾虎鱼科鱼类分类条形码的有效性。

鉴定南四湖须鳗虾虎鱼是客观评价南水北调东线工程生态影响的现实问题。在形态学鉴定的基础上，本研究采用线粒体COI基因对照虾虎鱼亚科相近属，鉴定南四湖须鳗虾虎鱼的分类地位，探讨南四湖须鳗虾虎鱼的种群来源。

1 材料与方法

1.1 实验样品

实验用须鳗虾虎鱼采自南四湖。根据体形、颜色、透明度、头形（吻形、眼）、尾形、腹鳍是否愈合及有无吸盘等形态特征，参照《中国动物志》，硬骨鱼纲，鲈形目（五），虾虎鱼亚目进行初步分类、标号、拍照。

随机取 16尾，体长 6.9～19.5cm，体质量3.2～18.1g，取背部肌肉，于95%酒精中-20℃保存。取样后的样品鱼采用95%酒精固定或用10%甲醛固定后保存。

1.2 基因组DNA的提取

表1 用于序列比对和系统树构建的鱼类COI基因信息Tab.1 Fish COI gene information for sequence alignment and phylogenetic tree construction

将肌肉样本从酒精中取出，用蒸馏水冲洗干净，剪碎并彻底晾干，采用上海生工柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并定量。

1.3 引物设计和PCR扩增

用于扩增须鳗虾虎鱼COI基因片段的通用引物由上海生工生物有限公司合成，分别为：Fish F，5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′；FishR，5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3。PCR 反应体系（50μL）为：10×Buffer（含 Mg2+）5μL，dNTP（2.5 mmol/L）4μL，正、反向引物（10 mol/L）各 1μL，Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，5U/L）0.25μL，模板 DNA 2μL，补充 ddH2O至 50μL。反应程序为：95℃预变性5min；94℃ 变 性 30 s，55℃ 退 火 30s，72℃ 延 伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，合格产物由上海生工生物有限公司测序。

1.4 基因序列的下载

从GenBank数据库中下载虾虎鱼科17种鱼的COI序列。同属须鳗虾虎鱼相关序列仅检索到一条[12]。选取鲈形目虾虎鱼亚目塘鳢科乌塘鳢Bostrychus sinensis及鲈亚目石首鱼科黄姑鱼Nibea albiflora两种鱼类的序列作为外类群，构建系统进化树。本文所用的序列信息见表1。

1.5 序列分析

PCR产物经电泳检测后由上海生工生物技术有限公司测序。用DNASTAR、ClustalX软件对序列进行排序并辅以手工校正，采用Mega4.1软件计算序列碱基组成及种间遗传距离，分别用邻位连接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大似然法（Maximum Likelihood method，ML）构建进化树。NJ法构建进化树Bootstrap置信值重复抽样1000次，ML法Bootstrap分析重复抽样100次，分析虾虎鱼种间亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

测量南四湖须鳗虾虎鱼78尾，全长6.9～19.5mm，体质量0.85～18.6g。鉴别特征：体延长，侧扁，呈鳗形，背缘、腹缘几乎平直，近尾端渐细小。头圆形，略平扁，吻宽而圆钝，口裂几乎垂直，具许多外露的大犬齿，下颔具须。眼睛退化隐于皮下，圆凸，眼间隔稍宽。鱼体裸露无鳞，体呈红色带蓝灰色，腹部浅色。左、右腹鳍愈合成一浅白色圆形吸盘。背鳍1个，鳍棘与鳍条连续，起点位于体的前半部，鳍棘6根，鳍条30～48根，鳍棘与鳍条均埋于皮膜中，后端具一缺刻，与尾鳍不连，臀鳍和背鳍鳍条相对，同形，基部长，起点在背鳍第一或第二鳍条的下方，埋于皮膜中，后端有一缺刻，不与尾鳍相连。胸鳍短而圆，约为头长的1/3，尾鳍黑色、尖形。体呈红色带蓝灰色，腹部浅色（图1）。鉴定为鳗虾虎鱼属须鳗虾虎鱼。

图1 南四湖须鳗虾虎鱼Fig.1 Taenioides cirratus in Nansi Lake

2.2 线粒体COI基因片段序列分析

PCR扩增得到16个须鳗虾虎鱼扩增条带，经测序比对得到633bp基因片段，具有作为条形码的长度条件[13]。16条序列仅检测到1种单倍型，未发现碱基插入和缺失。A、T、G、C四种碱基平均含量分别为：23.4%、28.7%、20.1%和27.8%，其中A+T平均含量（52.1%）略高于G+C平均含量（47.9%）。

表2 南四湖须鳗虾虎鱼COI基因部分序列中各碱基平均分布频率（%）Tab.2 Average nucleotide frequencies（%）of COI partial sequences in Taenioides cirratus（Nansi Lake）

如表2所示，在密码子位点中4种碱基平均含量差别较大，G含量偏低，尤其在第三密码子位点上。第一密码子位点G+C含量（57.9%）显著高于第二（43.1%）和第三密码子位点（42.6%）。

2.3 遗传距离

运用Kimura-2-parameter模型计算种间遗传距离（表3），种间遗传距离平均为0.212。南四湖须鳗虾虎鱼与须鳗虾虎鱼（KJ944420）遗传距离最小为0.116，与同属鲡形鳗虾虎鱼遗传距离为0.117，须鳗虾虎鱼（KJ944420）与鲡形鳗虾虎鱼（KX254501）遗传距离为0.015，所研究鱼类中同为刺虾虎鱼属的斑尾刺虾虎鱼（KU944920）与刺虾虎鱼（HQ536247）遗传距离最小为0.007。

2.4 分子系统进化树

以COI基因部分序列为标记，对所选20种鱼的COI基因序列构建NJ及ML系统进化树（图2、图3）。两种方法构建的进化树拓扑结构基本一致，具有较高的节点支持率。须鳗虾虎鱼与鲡形鳗虾虎鱼聚在同一分支内，再与南四湖须鳗虾虎鱼聚于一支。

3 讨论

3.1 形态分类学特征

国外学者根据解剖特征、Cyt b分子标记等将鳗虾虎鱼类归为虾虎鱼科的一个亚科[14,15]。国内学者从体形、背鳍、臀鳍、尾鳍的连结程度及眼睛退化程度等将鳗虾虎鱼类定为科级[16]。伍汉霖等[5]记述了中国产虾虎鱼类的9科5亚科106属307种（含1新种），对中国虾虎鱼类的分类编撰中，将鳗虾虎鱼类归为近盲虾虎鱼亚科。主要识别特征为：（1）左右腹鳍愈合为一吸盘；（2）体呈鳗形，无侧线，眼睛高度退化，体呈红色；（3）背鳍、臀鳍与尾鳍相连。鳗虾虎鱼属的主要检索依据为：下颌缝合部后方无犬齿；胸鳍具鳍条20以下，较小，短于腹鳍；口裂几乎垂直。鳗虾虎鱼属中国有2种：鲡形鳗虾虎鱼和须鳗虾虎鱼。二者的主要分类区别在于：背鳍和臀鳍后端有无缺刻，是否与尾鳍相连，头长大于或小于腹鳍基部后缘至肛门的距离。南四湖须鳗虾虎鱼背鳍和臀鳍后端各有一缺刻，不与尾鳍相连，头长明显小于腹鳍基部后缘至肛门的距离，符合须鳗虾虎鱼的形态特征。

图2 NJ法构建的虾虎科鱼类分子系统树Fig.2 NJ tree according to partial sequences of COI gene of Gobiidae

3.2 COI基因序列特点

本研究中，基因片段的碱基组成中G含量最低，这与其他鱼类mtDNACOI基因同源序列的碱基特点相一致[17-19]。南四湖须鳗虾虎鱼COI基因序列AT含量（52.1%）明显高于GC含量（47.9%）。金逍逍等[20]分析了26种虾虎鱼线粒体全基因组，发现不同区段中A+T的含量均超过50%，碱基G低含量偏倚；澳大利亚学者分析了207种鱼类的COI基因序列，其中143种硬骨鱼类的GC平均含量为47.1%，61种软骨鱼类GC平均含量为42.2%[21]，表明AT含量高可能是鱼类mtDNA COI基因碱基组成的普遍现象。本研究中，第一密码子位点G+C含量（57.9%）显著高于第二和第三密码子位点（43.1%，42.6%），核苷酸碱基构成的偏倚是线粒体蛋白质编码基因的显著特征[22]。该结果与多数虾虎鱼研究结果一致，但有研究分析长江口七种虾虎鱼类的基因序列特点，发现第三位碱基GC含量最高[11]。分析虾虎鱼科鱼类的COI基因的碱基特点，可扩大样本作进一步研究。

图3 ML法构建的虾虎科鱼类分子系统树Fig.3 ML tree according to partial sequences of COI gene of Gobiidae

表3 个体间遗传距离Tab.3 Genetic distance in species

3.3 COI基因用于南四湖须鳗虾虎鱼物种鉴定的可行性

COI基因序列鉴别物种有效性的关键是种间遗传距离大于种内遗传距离，且距离差异约10倍[23,24]。本研究结果表明，COI基因可用于虾虎鱼的分类鉴定。Hebert等[9]分析了11个动物门13 320个物种，结果表明物种内遗传距离临界值为0.020，多数种内遗传距离小于0.010。南四湖须鳗虾虎鱼与取自福建兴化湾的须鳗虾虎鱼之间遗传距离最小为0.116，说明取自南四湖的须鳗虾虎鱼与取自福建兴化湾的须鳗虾虎鱼在遗传变异上已超出种的分化水平。须鳗虾虎鱼与鲡形鳗虾虎鱼遗传距离为0.015，推断二者遗传变异尚未达到种的分化水平。依据本实验结果，取自福建兴化湾的须鳗虾虎鱼可能为鲡形鳗虾虎鱼的不同地理种群，其分类地位有待作进一步确认。基于COI基因部分序列构建的NJ与ML进化树拓扑结构基本保持一致，推断须鳗虾虎鱼与鲡形鳗虾虎鱼聚为一支后与南四湖的须鳗虾虎鱼聚为一支，且节点支持率很高，支持划为一个属，即同为鳗虾虎鱼属。

线粒体COI序列的差异可作为物种分类的有力佐证，但不是唯一标准，物种分类既要考虑形态特征，还要参考生态习性、生殖隔离等因素[25]。于亚男等[11]研究了13种虾虎鱼的COI基因种间和种内遗传距离，证实了COI基因可有效作为虾虎鱼科鱼类分类条形码。赵亮等[26]认为，可根据COI基因序列的差异区分弹涂鱼和大弹涂鱼。用COI基因序列标记分析的雷州半岛红树林海区5种虾虎鱼进化结果与传统形态学分类研究一致，证明可用线粒体COI基因分析虾虎鱼类的系统进化[27]。宋超等[28]对比了线粒体16S rRNA和COI基因片段在长江口虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类研究中的适用性，其中，16S rRNA和COI基因序列均具有较强的种间鉴别能力。虾虎鱼在COI基因中近缘关系相对较近，不能有效区分不同属的虾虎鱼。虾虎鱼种类鉴定可采用mtDNA的其他部分序列，如16S rRNA、D-loop、ND或其他编码区基因做进一步的研究分析以弥补COI序列的不足。

3.4 须鳗虾虎鱼在南水北调湖群间的种群扩散

须鳗虾虎鱼为穴居底层鱼类，繁殖力较低，迁移扩散能力较弱。庄平等[4]和伍汉霖等[5]报道在江苏京杭大运河上的洪泽湖存在须鳗虾虎鱼群体。2011年渔业调查在南四湖渔获物中出现了须鳗虾虎鱼，目前已能在南四湖下级湖区自然繁殖。推测可能是2002年随南四湖生态补水进入，经过几年的种群扩散并建立种群。

历史上南四湖由南北大运河连接，北接东平湖联通黄河，南经骆马湖、洪泽湖可达长江，湖沼湿地水体间存在联系和交流，是我国东部水系间南北物种交流的重要廊道[29]。近几十年来，受气候变化及人为干扰的影响，大运河廊道已处于瘫痪状态，各水体间联系减少，湖泊物种相对隔离。2002年12月，国家防汛抗旱总指挥部和水利部实施长江向南四湖应急生态补水。2007年，南四湖曾经绝迹多年的湖鲚Coilia ectenes、间下Hyporhamphus intermedius和大银鱼Protosalanx hyalocranius重新出现。李秀启等[30]推测湖鲚为当时随洪泽湖、骆马湖调水迁移进入并成功在南四湖扩散建群。利用京杭大运河向南四湖生态补水，及南水北调东线工程的调水，使相联水系融会贯通，为生物类群提供了短期快速迁移的机会。

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Application of DNA Barcoding Gene COI for Identifing Taenioides cirratus in Nansi Lake

WANG Ya-nan,LI Xiu-qi,KE Han,CONG Xu-ri,SHI Ji-hua
（Freshwater Fisheries Research Institute of Shandong,Shandong Provincial Key Laboratory of Freshwater Genetic Breeding,Jinan 250013,China）

Mitochondrial COI gene sequence was a popular marker of DNA barcoding for species identification in the kingdom of animals.In this paper,mitochondrial COI genes were sequenced in sixteen specimens of Taenioides cirratus collected from the Nansi Lake and about 633 base pairs were collected.Sequences from homologous regions of seventeen other species of Gobioidei familiy were gathered from Genbank.The results showed that the maximal GC was observed in the first base of condon,with higher average content in A+T than that in G+C.The genetic distance between species and the structure feature of phylogeny tree indicated that Taenioides cirratus from Nansi Lake and Xinghua Bay are in the closest relationship.The appearance of Taenioides cirratus in the Nansi Lake may be affected by the east route of South-to-North water transfer project.

Taenioides cirratus;COI gene;species identification;Nansi Lake

S917

A

1005-3832（2017）06-0012-07

2017-07-04

公益性行业（农业）科研专项经费（201303050）；山东省2016年度农业重大应用技术创新课题.

王亚楠，女.E-mail:wangyanan830513@163.com

李秀启（1968～），男，副研究员，从事鱼类生态学研究.E-mail:xiuqili@126.com