一种急性肝损伤再生修复模型的建立

王朝阳，朱美意，张宏伟，欧阳军

随着对肝脏疾病研究的不断深入，肝脏模型的要求也在不断提高和发展，建立一种理想且简单的急性肝损伤修复模型，对研究肝损伤、肝修复、肝移植等具有重要意义。目前，常见的急性肝损伤模型主要有病毒性模型、免疫性模型及化学性模型[1-3]，以及Higgins和Aderson[4]建立的70%肝切除模型，此切除模型应用广泛，但仍存在出血多，操作复杂等缺点。理想的肝损伤修复动物模型应至少具备以下特点：（1）符合伦理要求，避免伦理因素的制约；（2）取材方便、经济实惠、可利用度高且易在各类实验室推广；（3）操作简单、技术成熟、易于被各类科研工作者所掌握；（4）模型稳定、可重复性高、制作周期短、实用性强、成功率高；（5）模型能准确再现肝损伤后、肝再生修复的演进及其发展，不改变其原始状况，且能为各类干预措施搭建稳定的平台并进行客观公正的评估；（6）损伤后再生修复的肝组织是研究肝再生修复的“金标准”材料；（7）对人体安全无危害、环境污染小。目前，尚无一种肝损伤模型能够满足上述全部要求，本实验尝试性进行了肝左外叶70%切除术造模，获得了一种理想的肝急性损伤模型，经文献复习，目前鲜有单纯肝叶部分切除造模的报告及应用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 5周龄、清洁级斯泼累格·多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠30只，体重（180±10）g，雌雄不限，由新疆医科大学动物饲养中心[许可证号XJZZQ（XK）200301]提供，由石河子大学医学院第一附属医院动物饲养中心分笼饲养，保持12 h光照、12 h避光循环，恒温恒湿、标准饲料、自由饮水。经适应性饲养1周后，按照随机抽样原则将其分为对照组和实验组，共5组，每组6只，其中A组为空白对照；B组为术后6 h（实验组）；C组为术后12 h（实验组）；D组为术后3 d（实验组）；E组为术后7 d（实验组）。所有大鼠均通过石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审核。

1.2 手术耗材 手术解剖器械购自上海金钟手术器械公司，4-0爱惜康丝线购自强生医疗器材有限公司，生理盐水及无菌纱布由石河子大学医学院第一附属医院提供。

1.3 麻醉及围手术期处理 术前大鼠不做特殊处理，自由饮水和进食，恒温25～27℃，恒湿45%～55%。麻醉方法如下：将大鼠放入棕色玻璃瓶内，往瓶内放入浸润有乙醚的小棉球，待其出现呼吸变慢，活动度明显降低时，则表示已进入麻醉期，将大鼠取出并将乙醚棉球放于其鼻部，以维持麻醉作用时间。

1.4 手术方法 各组大鼠均采用肝左外叶部分切除术，首次切除70%肝叶。对照组立即于尾缘静脉取血进行丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平测定，并且立即再次手术切除残存肝左叶苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）；各实验亚组分别间隔6 h、12 h、3 d、7 d后于尾缘静脉取血进行ALT、AST生化检测，并且再次手术切除残存肝左外叶，手术方法如下：本手术为无菌手术，所有器械均经过高压灭菌，手术均在上午11：00～12：00进行，排除手术操作所引起的误差；术前10 h禁食、不禁水，乙醚吸入麻醉，待麻醉平稳后仰卧位固定于解剖台上，常规备皮，碘酒、乙醇消毒手术野，铺巾，沿上腹正中行一长约2 cm纵形切口，依次切开皮肤、肌层和腹膜，自制拉钩充分暴露手术野，锐性分离肝周韧带，游离肝左外叶，轻轻提起，以无齿镊小心夹住肝左外叶长度约70%处，以阻断远端血供，待肝远端颜色由红色变为暗紫红色，表明血管阻断成功，此时沿无齿镊外缘小心切除肝叶，创面使用单极电刀电凝止血，生理盐水清洗创缘，探查无出血，所剩肝脏血运良好后，采用4-0医用丝线进行腹膜和肌层“8”缝合和皮层的单纯连续缝合，关闭腹腔（图1）。术后送回清洁级鼠盒，待大鼠自然苏醒后即可自由进食进水。术前、术中和术后不用任何抗生素及其他类药物，手术平均时长20～25 min，手术过程中体温维持在约37℃[5]。各实验亚组分别间隔6 h、12 h、3 d、7 d，再次沿原切口逐层进腹，轻轻游离粘连组织，充分暴露残余肝左外叶，并用4号丝线于肝左外叶蒂部结扎，迅速切除残余肝左外叶，探查无出血，所剩肝脏血运良好后，原方法关闭腹腔。术后送回清洁级鼠盒，待大鼠自然苏醒后即可自由进食水。术前、术中和术后不用任何抗生素及其他类药物，手术平均时长20～25 min，手术过程中体温维持在约37℃[5]。术中无大血管及腹腔脏器损伤等严重并发症发生。

1.5 术后观察及生理生化指标检测 （1）观察对照组及各实验组大鼠存活率及一般情况：各组初次术后及二次术后各个时间点的存活率和病死率，建模后（二次术后）一周大鼠存活率；（2）对照组及各实验组大鼠血生化指标检测：各组大鼠于二次手术切除残存肝左外叶前经尾缘静脉取血1 ml，4℃，3000 r/min离心5 min（离心半径r=10 cm）后取血清，标本送至石河子大学医学院第一附属医院检验科检测ALT、AST水平；（3）肝脏组织切片HE染色及病理学观察：采用常规石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察残存肝组织病理学改变，由石河子大学医学院第一附属医院病理科协助完成。

图1 肝左叶70%切除术造模过程

1.6 统计学处理 各组大鼠均进入统计分析，中途无遗失，应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，不同时间点ALT和AST分析采用重复测量方差分析，方差协方差矩阵是否满足H型条件的假设检验采用Mauchly球形检验，校正系数用G-Gε；对于不同时间点各检测指标之间的比较，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 术后行为学观察及存活率统计 与对照组相比，实

验组二次术后大鼠毛发略凌乱、光泽度降低，精神萎靡、嗜睡，活动量减少，对外界刺激反应迟钝。初次及二次术后所有大鼠均存活，切口愈合良好，无感染渗血等并发症的发生，二次术后精神、活动及食欲恢复良好，一周存活率100%，提示可能造模成功。E组二次术前可见残肝断面消失，残余肝叶几乎完全恢复到原体积和结构。

2.2 血液生化检查 （1）与0 h比较，术后7 d内的ALT水平在术后7 d达到最低值，逐渐恢复至0 h水平。重复测量方差分析显示，重复测量数据的方差协方差矩阵不满足H型条件（χ2=21.928，P＜0.05，G-Gε=0.580）。时间与处理的单独效应显示：术后各个时间点ALT均值与0 h比较，6 h、12 h、3 d ALT水平均低于0 h，差异均具有统计学意义（P＜0.001），术后7 d ALT与0 h比较，差异无统计学意义（t=1.129，P=0.283）。（2）与0 h比较，术后7 d内的AST水平在术后7 d达到最低值，逐渐恢复至0 h水平。重复测量方差分析显示，重复测量数据的方差协方差矩阵不满足H型条件（χ2=34.601，P＜0.001，G-Gε=0.463）。时间与处理的单独效应显示：术后各个时间点AST均值与0 h比较，6 h、12 h、3 d AST水平均低于0 h，差异均具有统计学意义（P＜0.001），术后7 d AST与0 h比较，差异有统计学意义（t=2.756，P=0.040，表1）。

2.3 组织病理学检查 HE染色病理分析结果显示，对照组：肝组织结构正常，肝细胞轮廓清晰，形态较为规则，胞浆均匀红染，细胞核大小正常，核质淡染，肝细胞无变性、坏死等；肝细胞索排列整齐并以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构清晰呈多边形，大小基本一致，小叶间分界清楚，无明显充血、变形、坏死病理改变。实验组：可见正常肝小叶结构紊乱，出现灶状坏死，肝小叶界限模糊、扭曲变形，中央静脉偏离或消失，肝细胞索排列紊乱，失去正常放射状排列，肝细胞变性、坏死，细胞核偏心分布，部分细胞胞核消失，间质充血伴有炎性细胞浸润，肝窦扩张其内红细胞淤积，肝窦腔隙消失，肝脏组织结构明显破坏（图2）。

3 讨 论

肝脏是机体执行解毒和代谢自稳态功能的主要器官[6]，而肝脏病变事对人类健康威胁最严重的疾病之一[7,8]，如急性肝损伤。目前学术界公认，急性肝损伤是肝实质细胞遭到严重急性损害的结果[9]，但其具体机制目前尚未完全阐释，更不清楚损伤后再生的确切分子机制[10-12]。因此，建立稳定、有效的急性肝损伤修复动物模型是研究其损伤机制、再生及防治的关键性技术[13,14]。目前从模型的形成机制考虑，可供选择的急性肝损伤动物模型有很多。常见有药物性或化学性损伤模型及实验手术模型；然而，采用单纯性肝叶部分切除，建立急性肝损伤模型未见报道。

表1 各组大鼠血清ALT/AST浓度水平比较（U/L

表1 各组大鼠血清ALT/AST浓度水平比较（U/L

注：ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；与0 h比较，①P＜0.05

组别 0 h 术后6 h 术后12 h 术后3 d 术后7 d F值 P值ALT 38.68±0.40 200.15±1.24① 449.93±1.49① 55.87±0.88① 39.08±0.77 178708.24 ＜0.001 AST 60.97±0.41 257.48±1.19① 755.70±1.00① 75.65±0.33① 62.23±0.29① 957037.84 ＜0.001

图2 各组大鼠肝脏组织HE染色

与传统手术模型相比，本研究所采用的造模方法肝损伤程度小，经生理生化检测满足模型建立成功的各项指标，并且本研究中造模方法操作简便，实验动物存活率高达100%，既有效建立了急性肝损伤模型又达到了实验动物不致死且高效利用的目的。Higgins 和Anderson[4]创建的全肝2/3（70%）切除，这一模型已在 70 多年的研究中得到了广泛应用[15]，但存在以下缺点：（1）对操作要求较高，需要精确结扎肝左外叶和右叶根部，易导致肝破裂出血甚至死亡，且不能达到准确的70%肝切除量；（2）由于全肝70%被结扎后切除，循环于肝内血液也一同丢失而降低了血容量，术后发生肝功能衰竭的风险也随之加大，死亡率也随之加大；（3）当全肝70%切除后，可引起门脉压力的升高[16]，而出现门脉高压症甚至胃肠道淤血，为进一步研究肝损伤带来了众多干扰；（4）该方法建立的肝损伤模型，经常出现肝脏腔静脉狭窄和保留肝叶缺血坏死[17,18]；（5）该模型中肝再生不是被切除的肝叶重新长出，而是残余肝细胞的增生[19]，由于该方法是完整的肝叶切除，因此这种肝再生并不能重新长出被切除的肝左外叶和右叶[4]；（6）实验取材往往需要处死动物，增加了实验动物数量和科研成本，降低了实验动物的利用率，有违实验动物伦理核心理论的“3R”原则[20-22]。随着人类文明的进步，实验动物的福利及伦理问题引起人们的重视[23]，已在许多国家得到实施和推广[24,25]，全球每年约有数十亿只动物被用于科学研究，其中大部分用于生物医学领域[26]，且近多年来，实验用鼠的数量约以23%的比例逐年递增[27]，为此笔者希望在符合科学真实性原则的情况下，遵循“3R”原则并在科研工作中得到落实和体现。本研究造模后大鼠一周存活率100%，因此模型中的实验动物还可用于其他技能教学研究，如清创缝合、切开缝合等外科基本操作外，也可用于胃大部切除术、脾切除术、阑尾切除术、胃-空肠吻合术等外科手术实习，这样可以在同一只实验动物上进行互不影响的多项实验，不仅降低了实验动物使用量，而且增加实验动物的利用率，又大大减少了科研财力的消耗。

此外，本研究明确了单纯性肝左外叶部分切除，急性肝损伤模型的建立。大鼠肝右叶、肝中叶分别被其内的“裂隙”分为右上外叶和右下外叶、右中叶和左中叶；尾状叶被其内的“裂隙”分为上下两部分[28]，只有左外叶相对“完整”无裂隙，故首选左外叶部分切除，这不仅降低了操作难度，而且极大地提高了操作精确度。肝叶部分切除后的最基本病理变化是肝修复再生[29]，左外叶70%切除后断面残余肝细胞通过有丝分裂形成新细胞，在切除后第7天几乎完全恢复了左外叶形状，很好地诱导了肝急性损伤后的再生修复；另外，上腹正中切口能更好地显露肝脏，开腹即所见肝左外叶，避免术中对肝脏过多地翻动按压，造成局部微血栓形成，大大降低了潜在风险的影响，而且较传统Pringle法[30,31]相比，有效地避免了肝脏缺血再灌注的损伤和术后残肝细胞再生不良[32,33]，术中肝组织切面平整，剩余肝叶不易感染，同时可显著降低因结扎而导致下腔静脉阻塞的发生风险，与临床肝段切除术更接近。

麻醉药物的选择也是影响实验精确度的重要因素，如果麻醉药物选择不当可引起实验动物的不必要死亡。本模型采用乙醚吸入麻醉，有效地避免了水合氯醛和戊巴比妥钠经肝代谢而产生的影响，也避免了对AST和ALT的影响。当肝细胞发生急性损伤时，肝细胞膜通透性增加，ALT和AST即从细胞内逸出，使血液ALT、AST水平升高[34]，在一定程度上反映肝细胞的损伤程度[35]，而血液ALT、AST升高被认为是判断急性肝损伤严重程度的重要指标[36]。有研究显示在肝损伤12 h时，其血液ALT和AST持续升高达高峰，12 h后血液ALT、AST 和组织观察肝脏的损伤程度逐渐降低，并且于第3天逐渐恢复正常[37]，说明可能随着肝损伤的逐渐修复其血液中ALT和AST逐步降低，并且可能处于肝损伤修复过程中。本实验过程中，实验组6 h、12 h、3 d、7 d可见血液中ALT、AST含量显著增高,提示肝细胞受损严重，进一步肝组织病理学检测发现，实验组大鼠肝小叶结构破坏及肝细胞肿胀、坏死，而对照组肝组织正常。另外，从形态学观察，E组（7 d）于二次术前肉眼可见残肝断面消失、残余肝叶几乎完全恢复到原体积和结构，与Michalopoulos等[15,38]研究相一致。因此，本实验肝左叶70%切除后，综合分析血液ALT和AST变化特征并结合HE染色病理学改变、行为学改变、形态学改变，考虑该模型可能符合急性肝损伤修复模型。

总之，本模型采用单纯性肝左外叶切除术，是急性肝损伤再生修复模型的重要体现。该方法不仅操作简单、易被各类学者所掌握，而且实验动物存活率和模型成功率高；该模型不仅可研究肝损伤、肝再生、肝移植等搭建稳定的平台，而且可对各类干预措施进行客观评估。

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