基于原子力显微镜的不同固化液对肾细胞固化状态的影响

摘 要：细胞固化技术是利用介质将活细胞固定在反映溶液中，且尽可能完整的保存细胞的原有结构。针对细胞固定过程中遇到的细胞破裂、细胞过渡收缩、细胞核固定性差等问题，本文采用原子力显微镜对甲醇、戊二醛、丙酮固定的肾细胞进行形貌测量。经对比分析发现戊二醛对肾细胞的固化能够更完整的保存细胞的原有结构。

关键词：细胞固化；原子力显微镜；细胞测量

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.24.251

1 引言

原子力显微镜是通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。它可以实现对样品的“推”、“拉”、“刻划”、“切割”、“搬运”等操作功能[1]。还可以实现样品的表面成像、粗糙度测量、高度测量等检测功能。传统观测细胞的仪器为光学显微镜，其分辨率在微米级别，且不能准确的得出所观测细胞的尺寸、粗糙度、高度等信息。而原子力显微镜具有纳米级分辨率，可在空气或者各种近生理条件下工作，直接探测生物细胞的高度、直径、体积、弹性等信息，能够在微/纳尺度上更加详细地了解和掌握生物细胞的表面形貌、结构特征、功能及特性等。这种优势使其正逐渐发展为细胞生物学研究中的有效工具。但是，因细胞具有一定的柔性，直接在生理溶液中对细胞进行原子力显微镜成像，会有成像分辨率不高、细胞膜表面蛋白成像不稳定等缺点。因此为获得较高的细胞表面成像的分辨率，我们常会利用固化剂对细胞进行固化处理，虽然经固化剂处理后，细胞失去了活性，但对于细胞骨架、细胞膜表面褶皱、细胞器、微绒毛等研究却有不可或缺的作用。

2 固化细胞形貌成像

传统的细胞固定剂有95%酒精、乙醚酒精液、甲醇、冰醋酸、无水酒精、丙酮、Carnoy固定液、10%中性缓冲甲醛液等多个种类。但由于乙醚、丙酮等具有挥发性和毒性，对人身体有害，已很少用于常规细胞学的固定。常用的细胞固定剂多为醛类固定剂，且以甲醛类和戊二醛最为常用。本文采用最常用的固定剂，丙酮、2.5%戊二醛、甲醇对肾细胞进行固定，并获得固定后的肾细胞形貌图像。

2.1 生理溶液下观察肾细胞

正常肾细胞是在37摄氏度环境中，贴壁生长于培养液中。本实验是将贴壁生长两天的肾细胞从培养箱中取出，并更换新的培养液。更换培养液是不可或缺的重要步骤，可以防止细胞生长过程中死亡的漂浮细胞或杂质刮到探针针尖上，影响实验结果。图1为正常生理溶液下肾细胞形貌图像。可见细胞伸展状态良好，细胞表面较光滑，细胞之间通过触角联系密切。但扫描过程中会有拉线情况出现，影响成像质量。

2.2 观察2.5%戊二醛固定剂固化的肾细胞

2.5%戊二醛固定剂是常用的细胞固定剂，该固定剂固定速度快、穿透性强，可以很好的保存细胞的微细结构。2.5%戊二醛固定剂配制方法：量取25%的戊二醛溶液10ml，置于三角烧瓶中，加入双蒸馏水40ml，0.2mol/L磷酸缓冲液50ml，充分混匀[2]。图2为2.5%戊二醛固定剂固化后的肾细胞形貌图像。可见2.5%戊二醛固定剂處理后的肾细胞，表面相对平滑，没有明显的孔洞，细胞边缘较清晰。与正常生理溶液下观察到的肾细胞形貌图像差别不大。

2.3 观察甲醇固定剂固化的肾细胞

甲醇固定剂具有固定时间快，细胞收缩小，细胞核保存较好，结构清晰等优点。图3为甲醇固定剂固定后的肾细胞形貌图像。图4为

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甲醇固定剂固定肾细胞后，肾细胞的边缘形貌图像。由甲醇固定剂处理后的肾细胞形貌图可见，细胞表面侵蚀出许多孔洞样结构。说明甲醇侵蚀了肾细胞的细胞膜，使肾细胞产生了损伤。从图4可以清晰的看到细胞的边缘细微结构，说明肾细胞的微绒毛固化的相当清晰完好。

2.4 观察丙酮固定剂固化的肾细胞

丙酮处理后的肾细胞形貌如图5所示。可清晰的观察到细胞表面有多处皲裂的痕迹，且细胞边缘不清晰，说明细胞脱水严重，在固化的过程中受到极大的损伤。由图6可见，细胞边缘触角收缩为一团。与正常生理溶液中的活细胞相比，经丙酮固化后的肾细胞形貌结构变化较大。

3 结论

细胞形貌、结构与细胞的生理状态和功能有着重要的联系，原子力显微镜对细胞表面形貌学研究与临床研究的关系越来越密切，并具有广阔的应用前景。本文通过原子力显微镜对生理溶液下肾细胞、2.5%戊二醇固定剂固定的肾细胞、甲醇固定剂固定的肾细胞、丙酮固定剂固定的肾细胞进行形貌测量。经对比分析发现甲醇固定剂会很好的固定细胞边缘的细微结构，但是却会侵蚀细胞表面，使细胞表面产生孔洞样结构。丙酮固定剂会使细胞脱水严重，细胞表面会发生皲裂，且细胞边缘触角会收缩成团，肾细胞形貌较生理溶液中的细胞变化较大。而2.5%戊二醛固定剂对肾细胞的固化能够更完整的保存细胞的原有结构，使细胞更接近于生理溶液中活细胞的形貌结构状态。根据实验结果显示，对于进一步研究细胞的亚结构，如细胞膜结构的褶皱，细胞表面的层状脂肪物，微端丝和微绒毛[3]等，2.5%戊二醛固定剂固定细胞样品是很好的细胞样品制备方式。

参考文献：

[1]刘兰娇.原子力显微镜在纳米技术中的应用[J].山东工业技术，2014，22

（34）：194-195.

[2]庄乐南，齐浩，孙润广.不同固定条件下细胞与活细胞的原子力显微镜实时观察[J].生物物理学报，2005，21（05）：345-349.

[3]吴爱国，魏刚，李壮.原子力显微镜技术对生物样品的研究[J]. 分析化学，2004，32（11）：1421-1425.

作者简介：张文晓（1988-），女，满族，吉林梅河口人，硕士研究生，实习研究员，研究方向：纳米操纵及测量。endprint